TBK1在高级别脑胶质瘤髓样细胞中的表达特征.pdf
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1、论著(收稿日期:2 0 2 3-0 3-10)682脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期miRNA and PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in cancerJ.LifeSci,2021,285:119984.5Rost NS,Brodtmann A,Pase MP,Post-stroke cognitive impairmentand dementiaJ.Circ Res,2022,130(8):1252-1271.6Mosconi MG,Paciaroni M.Treatments in ischemic stroke:currentand fu
2、tureJ.Eur Neurol,2022,85(5):349-366.7Zhang Z,Qin P,Deng Y,Ma Z,The novel estrogenic receptor GPR30alleviates ischemic injury by inhibiting TLR4-mediated microglialinflammationJJ.J Neuroinflammation,2018,15(1):206.8Rehni AK,Cho S,Dave KR.Ischemic brain injury in diabetes andendoplasmic reticulum stre
3、ssJJ.Neurochem Int,2022,152:105219.9Mohamud Yusuf A,Hagemann N,Roles of Polymorphonuclearneutrophils in ischemic brain injury and post-ischemic brain remodelingJJ.Front Immunol,2022,12:825572.10 Vilimanovich U,Bosnjak M,Bogdanovic A,et al.Statin-mediatedinhibition of cholesterol synthesis induces cy
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5、ain injury independent of PAPK2J.Autophagy,2017,13(10):1754-1766.13 Cox FF,Misiou A,Vierkant A,Protective effects of curcuminin cardiovascular diseases-impact on oxidative stress andmitochondriaJ.Cells,2022,11(3):342.14 Zhang J,Jiang H,Liu DH,Effects of dexmedetomidine on myocardialischemia-reperfus
6、ion injury through PI3K-Akt-mTOR signalingpathwayJJ.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2019,23(15):6736-6743.15 Tsai WH,Wu CH,Yu HJ,et al.1-Theanine inhibitsproinflammatoryPKC/E R K/ICAM-1/IL-33 signaling,apoptosis,and autophagyformation in substance P-inducedhyperactive bladder in ratsJ.Neurourol Urodyn,201
7、7,36(2):297-307.16 刘志辉.立普妥对高糖诱导的HUVEC调亡及PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响.中国比较医学杂志,2 0 16,2 6(3):58-6 3.17Tian Y,Guo S,Zhang Y,et al.Effects of hydrogen-rich salineon hepatectomy-induced postoperative cognitive dysfunction inoldmiceJ.Mol Neurobiol,2017,54(4):2579-2584.TBK1在高级别脑胶质瘤髓样细胞中的表达特征李媛媛纪乐张劲然李忠尧李春岩 刘亚坤【摘要】
8、目的探讨TANK结合激酶1(TBK1)在高级别脑胶质瘤髓样细胞中的表达特征。方法选取2 0 19 年4月至2 0 2 1年2 月就诊于河北医科大学第二医院的2 7 例WH0分级标准为高级别胶质瘤患者作为研究对象,采用磁珠分选的方法检测胶质瘤瘤旁和肿瘤组织中整合素M(CD 11b)阳性髓样细胞中TBK1的表达,免疫荧光染色观察肿瘤微环境巨噬细胞中磷酸化TBK1(p-T BK 1)的表达,并通过流式细胞分析患者术前1d、术后10 14d外周血经典单核细胞中p-TBK1的表达变化。结果高级别胶质瘤肿瘤组织CD11b阳性细胞中TBK1总蛋白表达水平较瘤旁组织明显增多(P=0.006);高级别胶质瘤肿瘤
9、组织中p-TBK1蛋白水平较瘤旁明显升高,且p-TBK1的表达与CD68阳性巨噬细胞有共定位;高级别胶质瘤患者术后外周血经典单核细胞中p-TBK1表达较术前明显降低(P=0.001)。结论TBK1在高级别胶质瘤微环境髓样细胞中高表达,提示髓样细胞TBK1在胶质瘤的发展中可能起着关键调控作用。【关键词】高级别胶质瘤;髓样细胞;TANK结合激酶1中图分类号:R739.4文献标识码:A文章编号:10 0 6-351X(2 0 2 3)11-0 6 8 2-0 5Characteristics of TBK1 expression in high-grade glioma myeloid cellsL
10、i Yuanyuan,Ji Le,Zhang Shaoran,Li Zhongyao,Li Chunyan,Liu Yakun基金项目:河北省自然科学基金资助项目(H2022206105)作者单位:0 50 0 0 0 石家庄,河北医科大学第二医院神经内科(李媛媛、张劭然、李忠尧、李春岩、刘亚坤);河北医科大学第一医院神经外科(纪乐)通信作者:刘亚坤,Email:683脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 05000
11、0,ChinaCorresponding author:Liu Yakun,Email:Abstract Objective To investigate the expression characteristics of TANK binding kinase 1(TBK1)in myeloid cells in the tumor microenvironment of high-grade glioma.Methods A total of 27 patients with high-grade glioma admitted to the Department of Neurosurg
12、ery,the Second Hospital of Hebei Medical University fromApril 2019 to February 2021 were enrolled in this study.Magnetic activated cell sorting was used to detect theexpression of TBK1 in CD11b-positive myeloid cells from paratumoral and tumor tissues.The expression of p-TBK1in macrophages in the tu
13、mor microenvironment was observed by immunofluorescence staining,and the expressionof p-TBK1 in classical monocytes of peripheral blood from patients before and after surgery was analyzed by flowcytometry.Results The level of total TBK1 protein in CD1lb-positive cells of high-grade glioma was signif
14、icantlyincreased compared with that in adjacent tissues(P=0.006).The level of p-TBK1 protein in the tumor tissue ofhigh-grade glioma was significantly higher than that in the paratumoral tissue,and the expression of p-TBK1 wasobserved colocalized with CD68-positive macrophages.The expression of p-TB
15、K1 in peripheral blood classicalmonocytes of patients with high-grade glioma after surgery was significantly lower than that before surgery(P=0.001).Conclusion TBK1 is highly expressed in myeloid cells in the tumor microenvironment of high-grade glioma,suggesting that myeloid TBK1 may play a key rol
16、e in the development of glioma.Key wordsHigh-grade glioma;Myeloid cells;TANK binding kinase 1脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,高级别脑胶质瘤微环境具有丰富的髓样细胞,可抑制抗肿瘤免疫并促进肿瘤生长 I-2。T A NK 结合激酶1(TANKbindingkinase1,T BK 1)是一种多功能激酶,近年研究发现其与肿瘤进展密切相关 3-5。TBK1能够抑制T细胞活化,抑制树突状细胞中某些干扰素应答基因的表达调控免疫耐受,因而在抗肿瘤免疫中起重要作用16-7 。脑胶质瘤中TBK1高表达,但其在胶质瘤髓
17、样细胞中的表达特征尚不明确。因此,本研究初步探讨了TBK1在脑胶质瘤患者瘤旁和肿瘤组织髓样细胞中的表达,以及术前、术后外周血经典单核细胞中p-TBK1的表达变化,为明确髓系TBK1在脑胶质瘤中的作用提供实验依据。资料与方法1.一般资料选取河北医科大学第二医院2 0 19 年4月至2 0 2 1年2 月收治的2 7 例WHO分级标准为高级别胶质瘤患者作为研究对象,其中男性17 例,女性10 例;年龄19 7 6 岁,平均年龄(52.7 3.0)岁;病理分级级9 例,IV级18 例。纳人标准:高级别脑胶质瘤患者,经术前影像学及术后病理学确诊,符合WHO脑胶质瘤诊断标准;年龄 18 岁;接受外科手术
18、治疗,术前未行放、化疗治疗;临床资料完整。排除标准:存在严重心、肝、肾、肺、内分泌及自身免疫系统疾病患者;存在其他部位肿瘤或明显感染者;非初次发病,或已接受放疗、化疗等治疗者;临床资料不全者。本研究经本院医学伦理委员会批准(2 0 2 0-R174)。2.磁珠分选取胶质瘤瘤旁及肿瘤组织手术样本制备单细胞悬液,过2 0 0 目细胞滤网除去细胞团块或碎片。磷酸盐缓冲液洗涤细胞,涡旋CD11b磁珠(BDBiosciences),约10 7 个细胞加人50 l磁珠并混匀,6 12 孵育30 min。调整细胞密度至510/ml后,按磁珠分选说明书进行分选。3.蛋白印迹实验收集各组细胞,提取细胞总蛋白,用
19、BCA法测定蛋白浓度,配制SDS-PAGE胶,取等量蛋白样品进行凝胶电泳,电泳完毕,取出凝胶进行湿转膜。转膜结束后,取出PVDF膜,置于含5%脱脂奶粉的TBST(10 mM Tris-HCl,pH8.0,150 mM NaCl,0.05%Tween-20)封闭液中,在摇床上室温封闭1h后进行一抗 TBK1(a b c a m,a b 40 6 7 6)-actin(Pr o t e i n t e c h,60008-1-AP)孵育,4过夜,次日,进行二抗结合反应。最后在Odyssey红外凝胶成像系统(LI-COR,Lincoln,NE)扫膜仪扫膜并分析结果。4.免疫荧光染色取瘤旁和肿瘤组织的
20、冰冻切片,PBS清洗5min3次,用含0.0 3%的TritonX-100孵育30 min,之后用10%的马血清封闭30 min。然后加人相应的一 抗 CD68(a b c a m,a b 7 6 30 8)、p h o s p h o-T BK 1(c e l lsignalingtechnology,548 3),4过夜。次日,将标本684脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期取出,晾至室温后用PBS清洗5min3次,加人相对应的荧光二抗。室温避光孵育1h后,PBS清洗5min3次,然后加人Hoechst(In v i t r o g e n)染细胞核,室温避光孵育15min后,
21、PBS清洗5min3次,最后用抗荧光猝灭剂进行封片。晾干后在激光共聚焦显微镜下进行观察5.流式细胞学检测抽取胶质瘤患者术前1d和术后10 14d抗凝静脉血3ml,准备流式管,每管加入APC标记的鼠抗人CD14单抗(BD Biosciences,55539 9)6 l,Pe r CP-Cy5.5标记的鼠抗人CD16(BD Bi o s c i e n c e s,56 0 7 17)单抗2 1,取150 1抗凝血加入流式管中,振荡混匀,避光孵育15min。加入2 mlFACS溶血素,混匀作用15min,50 0 g,离心5min,弃上清,加人2 ml生理盐水,混匀,50 0 g,离心5min,弃
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