TBK1在高级别脑胶质瘤髓样细胞中的表达特征.pdf

论著（收稿日期：2 0 2 3-0 3-10）682脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期miRNA and PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in cancerJ.LifeSci,2021,285:119984.5Rost NS,Brodtmann A,Pase MP,Post-stroke cognitive impairmentand dementiaJ.Circ Res,2022,130(8):1252-1271.6Mosconi MG,Paciaroni M.Treatments in ischemic stroke:currentand futureJ.Eur Neurol,2022,85(5):349-366.7Zhang Z,Qin P,Deng Y,Ma Z,The novel estrogenic receptor GPR30alleviates ischemic injury by inhibiting TLR4-mediated microglialinflammationJJ.J Neuroinflammation,2018,15(1):206.8Rehni AK,Cho S,Dave KR.Ischemic brain injury in diabetes andendoplasmic reticulum stressJJ.Neurochem Int,2022,152:105219.9Mohamud Yusuf A,Hagemann N,Roles of Polymorphonuclearneutrophils in ischemic brain injury and post-ischemic brain remodelingJJ.Front Immunol,2022,12:825572.10 Vilimanovich U,Bosnjak M,Bogdanovic A,et al.Statin-mediatedinhibition of cholesterol synthesis induces cytoprotective autophagyin human leukemic cellsJ.Eur J Pharmacol,2015,765:415-428.11 Wang M,Wang J,Liu 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dysfunction inoldmiceJ.Mol Neurobiol,2017,54(4):2579-2584.TBK1在高级别脑胶质瘤髓样细胞中的表达特征李媛媛纪乐张劲然李忠尧李春岩 刘亚坤【摘要】目的探讨TANK结合激酶1（TBK1）在高级别脑胶质瘤髓样细胞中的表达特征。方法选取2 0 19 年4月至2 0 2 1年2 月就诊于河北医科大学第二医院的2 7 例WH0分级标准为高级别胶质瘤患者作为研究对象，采用磁珠分选的方法检测胶质瘤瘤旁和肿瘤组织中整合素M（CD 11b）阳性髓样细胞中TBK1的表达，免疫荧光染色观察肿瘤微环境巨噬细胞中磷酸化TBK1（p-T BK 1）的表达，并通过流式细胞分析患者术前1d、术后10 14d外周血经典单核细胞中p-TBK1的表达变化。结果高级别胶质瘤肿瘤组织CD11b阳性细胞中TBK1总蛋白表达水平较瘤旁组织明显增多（P=0.006）；高级别胶质瘤肿瘤组织中p-TBK1蛋白水平较瘤旁明显升高，且p-TBK1的表达与CD68阳性巨噬细胞有共定位；高级别胶质瘤患者术后外周血经典单核细胞中p-TBK1表达较术前明显降低（P=0.001）。结论TBK1在高级别胶质瘤微环境髓样细胞中高表达，提示髓样细胞TBK1在胶质瘤的发展中可能起着关键调控作用。【关键词】高级别胶质瘤；髓样细胞；TANK结合激酶1中图分类号：R739.4文献标识码：A文章编号：10 0 6-351X（2 0 2 3）11-0 6 8 2-0 5Characteristics of TBK1 expression in high-grade glioma myeloid cellsLi Yuanyuan,Ji Le,Zhang Shaoran,Li Zhongyao,Li Chunyan,Liu Yakun基金项目：河北省自然科学基金资助项目（H2022206105）作者单位：0 50 0 0 0 石家庄，河北医科大学第二医院神经内科（李媛媛、张劭然、李忠尧、李春岩、刘亚坤）；河北医科大学第一医院神经外科（纪乐）通信作者：刘亚坤，Email:683脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,ChinaCorresponding author:Liu Yakun,Email:Abstract Objective To investigate the expression characteristics of TANK binding kinase 1(TBK1)in myeloid cells in the tumor microenvironment of high-grade glioma.Methods A total of 27 patients with high-grade glioma admitted to the Department of Neurosurgery,the Second Hospital of Hebei Medical University fromApril 2019 to February 2021 were enrolled in this study.Magnetic activated cell sorting was used to detect theexpression of TBK1 in CD11b-positive myeloid cells from paratumoral and tumor tissues.The expression of p-TBK1in macrophages in the tumor microenvironment was observed by immunofluorescence staining,and the expressionof p-TBK1 in classical monocytes of peripheral blood from patients before and after surgery was analyzed by flowcytometry.Results The level of total TBK1 protein in CD1lb-positive cells of high-grade glioma was significantlyincreased compared with that in adjacent tissues(P=0.006).The level of p-TBK1 protein in the tumor tissue ofhigh-grade glioma was significantly higher than that in the paratumoral tissue,and the expression of p-TBK1 wasobserved colocalized with CD68-positive macrophages.The expression of p-TBK1 in peripheral blood classicalmonocytes of patients with high-grade glioma after surgery was significantly lower than that before surgery(P=0.001).Conclusion TBK1 is highly expressed in myeloid cells in the tumor microenvironment of high-grade glioma,suggesting that myeloid TBK1 may play a key role in the development of glioma.Key wordsHigh-grade glioma;Myeloid cells;TANK binding kinase 1脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，高级别脑胶质瘤微环境具有丰富的髓样细胞，可抑制抗肿瘤免疫并促进肿瘤生长 I-2。T A NK 结合激酶1(TANKbindingkinase1，T BK 1）是一种多功能激酶，近年研究发现其与肿瘤进展密切相关 3-5。TBK1能够抑制T细胞活化，抑制树突状细胞中某些干扰素应答基因的表达调控免疫耐受，因而在抗肿瘤免疫中起重要作用16-7 。脑胶质瘤中TBK1高表达，但其在胶质瘤髓样细胞中的表达特征尚不明确。因此，本研究初步探讨了TBK1在脑胶质瘤患者瘤旁和肿瘤组织髓样细胞中的表达，以及术前、术后外周血经典单核细胞中p-TBK1的表达变化，为明确髓系TBK1在脑胶质瘤中的作用提供实验依据。资料与方法1.一般资料选取河北医科大学第二医院2 0 19 年4月至2 0 2 1年2 月收治的2 7 例WHO分级标准为高级别胶质瘤患者作为研究对象，其中男性17 例，女性10 例；年龄19 7 6 岁，平均年龄（52.7 3.0）岁；病理分级级9 例，IV级18 例。纳人标准：高级别脑胶质瘤患者，经术前影像学及术后病理学确诊，符合WHO脑胶质瘤诊断标准；年龄 18 岁；接受外科手术治疗，术前未行放、化疗治疗；临床资料完整。排除标准：存在严重心、肝、肾、肺、内分泌及自身免疫系统疾病患者；存在其他部位肿瘤或明显感染者；非初次发病，或已接受放疗、化疗等治疗者；临床资料不全者。本研究经本院医学伦理委员会批准（2 0 2 0-R174）。2.磁珠分选取胶质瘤瘤旁及肿瘤组织手术样本制备单细胞悬液，过2 0 0 目细胞滤网除去细胞团块或碎片。磷酸盐缓冲液洗涤细胞，涡旋CD11b磁珠（BDBiosciences），约10 7 个细胞加人50 l磁珠并混匀，6 12 孵育30 min。调整细胞密度至510/ml后，按磁珠分选说明书进行分选。3.蛋白印迹实验收集各组细胞，提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，配制SDS-PAGE胶，取等量蛋白样品进行凝胶电泳，电泳完毕，取出凝胶进行湿转膜。转膜结束后，取出PVDF膜，置于含5%脱脂奶粉的TBST(10 mM Tris-HCl,pH8.0,150 mM NaCl,0.05%Tween-20）封闭液中，在摇床上室温封闭1h后进行一抗 TBK1（a b c a m,a b 40 6 7 6）-actin（Pr o t e i n t e c h,60008-1-AP）孵育，4过夜，次日，进行二抗结合反应。最后在Odyssey红外凝胶成像系统（LI-COR，Lincoln，NE）扫膜仪扫膜并分析结果。4.免疫荧光染色取瘤旁和肿瘤组织的冰冻切片，PBS清洗5min3次，用含0.0 3%的TritonX-100孵育30 min，之后用10%的马血清封闭30 min。然后加人相应的一 抗 CD68（a b c a m,a b 7 6 30 8）、p h o s p h o-T BK 1（c e l lsignalingtechnology，548 3），4过夜。次日，将标本684脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期取出，晾至室温后用PBS清洗5min3次，加人相对应的荧光二抗。室温避光孵育1h后，PBS清洗5min3次，然后加人Hoechst（In v i t r o g e n）染细胞核，室温避光孵育15min后，PBS清洗5min3次，最后用抗荧光猝灭剂进行封片。晾干后在激光共聚焦显微镜下进行观察5.流式细胞学检测抽取胶质瘤患者术前1d和术后10 14d抗凝静脉血3ml，准备流式管，每管加入APC标记的鼠抗人CD14单抗（BD Biosciences，55539 9）6 l，Pe r CP-Cy5.5标记的鼠抗人CD16（BD Bi o s c i e n c e s，56 0 7 17）单抗2 1,取150 1抗凝血加入流式管中，振荡混匀，避光孵育15min。加入2 mlFACS溶血素，混匀作用15min，50 0 g，离心5min，弃上清，加人2 ml生理盐水，混匀，50 0 g，离心5min，弃上清。固定破膜：加人5001细胞固定/破膜剂，避光孵育2 0 min，50 0 g，离心5min，弃上清，加入2 mlPerm/Wash缓冲液，避光反应10 min，50 0 g，离心5min，弃上清。加入PE标记的兔p-TBK1单抗1l，避光孵育30 min，加人2 ml生理盐水洗涤后重悬上机检测6.统计学方法采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以元s表示，两组间比较采用独立样本t检验或配对t检验，以P0.05为差异有统计学意义。结果1.高级别胶质瘤瘤旁和肿瘤组织CD11b阳性髓样细胞中TBK1的表达（图1）AparatumoraltumorparatumoraltumorparatumoraltumorB1.57paratumoraltissuenstumortissue1.0-aTBK10.5-actin工0.0CD11b+CD11b-A：蛋白印迹检测瘤旁和肿瘤组织CD11b阳性和阴性细胞中TBK1表达的代表性条带图；B：T BK 1蛋白表达相对定量统计图，与瘤旁组织相比，“P0.05图1高级别胶质瘤瘤旁和肿瘤组织CD11b阳性髓样细胞中TBK1的表达通过磁珠分选瘤旁和肿瘤组织中CD11b+髓样细胞（CD11b是一种泛骨髓标记）及CD11b细胞，蛋白印迹实验进一步检测TBK1在微环境髓样细胞中的表达特征。结果显示，高级别胶质瘤肿瘤组织中CD11b*细胞TBK1总蛋白表达水平较瘤旁组织明显增多（P=0.006），而在CD11b-细胞中，肿瘤组织较瘤旁组织TBK1表达有升高趋势（P=0.670）。2.高级别胶质瘤瘤旁和肿瘤组织巨噬细胞中p-TBK1的表达（图2）ACD68P-TBK1MergedJounA：高级别胶质瘤瘤旁和肿瘤组织CD68阳性巨噬细胞中p-TBK1表达的代表性免疫荧光图片B140CD68120P-TBK1100806040200121416181101121141B：Im a g e J软件分析p-TBK1的表达与CD68+巨噬细胞的共定位图2 高高级别胶质瘤瘤旁和肿瘤组织巨噬细胞中p-TBK1的表达TBK1的磷酸化修饰对其激酶活性有很重要的调节作用，TBK1的Ser172位点磷酸化能够强烈促进TBK1的活性。通过免疫荧光染色检测高级别胶质瘤瘤旁和肿瘤组织的CD68*巨噬细胞p-TBK1表达。结果显示，与瘤旁组织相比，肿瘤组织中p-TBK1蛋白水平明显升高，且p-TBK1的表达与CD68+巨噬细胞有共定位，提示在p-TBK1高级别胶质瘤肿瘤组织巨噬细胞中高表达。3.高级别胶质瘤患者术前、术后外周血经典单核细胞亚群变化（图3）招募到脑部的肿瘤浸润性髓系细胞来源于血液单核细胞。经典单核细胞（CD14+CD16）亚群与促进肿瘤发生和癌症转移有关。采集高级别胶质瘤患685脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期者术前1d和术后（10-14d）外周抗凝全血样本，流式分析患者术前和术后外周血经典单核细胞亚群的变化，结果显示，术前、术后外周血经典单核细胞亚群无明显变化（8 1.6%vs74.1%，P=0.2 0 0）APre-operationPost-operationns100.0-SOLQ2QIQ280.0OOL60.0-OL40.0Q420.0-2012L0P10.0103104106010210104105CD14APCCD14APCA流式分析患者术前和术后外周血经典单核细胞亚群的变化图3高级别胶质瘤患者术前、术后外周血经典单核细胞亚群变化4.高级别胶质瘤患者术前、术后外周血经典单核细胞中p-TBK1的表达变化（图4）APre-operationPost-operation8000a6000H4000-工P22000-80一102103104105102103104105P-TBK1PEP-TBK1PEpost-A：流式分析术前和术后CD14+CD16经典单核细胞中p-TBK1表达的代表性图片*P0.05B8000-pre-operationpost-operation6000-4000-2000-0B：流式分析2 7 例患者术前和术后CD14+CD16经典单核细胞中p-TBK1表达的平均荧光强度图4高级别胶质瘤患者术前、术后外周血经典单核细胞中p-TBK1的表达变化为了检测高级别胶质瘤患者外周血经典单核细胞中p-TBK1的表达是否存在异常，作者通过流式分析术前和术后CD14+CD16经典单核细胞中p-TBK1的表达变化。初步发现，术后外周血经典单核细胞中p-TBK1表达较术前明显降低，差异有统计学意义（P=0.001）。这些数据表明髓样细胞TBK1在胶质瘤的发展中可能起着关键调控作用。讨论脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，易复发，预后差。高级别胶质瘤微环境含有丰富的髓样细胞，占肿瘤的40%，可抑制抗肿瘤免疫并促进肿瘤生长-2 。脑胶质瘤髓样细胞大致可分为两类：脑驻留小胶质细胞，其起源于胚胎巨噬细胞并存在于健康的大脑中；肿瘤浸润性髓样细胞，是肿瘤发展中的关键调节因子，主要来源于血液单核细胞，在病理条件下募集到大脑 8-9 。肿瘤发生时血液单核细胞能够成熟为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophage，T A M），进而抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤侵袭、生长和转移。胶质瘤微环境中细胞因子、趋化因子如巨噬细胞集落刺激因子-1（macrophagecolony-stimulatingfactor，M-CSF）和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，M CP1）能够将异质性髓样细胞募集到肿瘤部位，使巨噬细胞和小胶质细胞向免疫抑制性、促肿瘤的M2型极化，进一步产生促血管生成、增殖和侵袭性因子等来促进肿瘤生长 10 TANK结合激酶1（TANK bindingkinase1，T BK 1）是一种多功能激酶，近年研究发现其与肿瘤密切相关，在多种肿瘤中具有致癌作用用 3-5。TBK1 在不同类型免疫细胞中也具有重要调控作用。实验研究中，T细胞、B细胞分别特异性敲除TBK1，表明TBK1调节T细胞迁移及NF-kB依赖的免疫球蛋白类转换-12 。Xian 等 研究表明，TBK1 在树突状细胞中起作用，可调节免疫耐受并抑制自身免疫。在胸腺瘤和黑色素瘤小鼠模型中，树突状细胞中TBK1缺失可抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期。树突状细胞是主要的抗原呈递细胞，并且是刺激感染中T细胞应答所必需的。TBK1抑制树突状细胞中某些干扰素应答基因的表达，这可能是解释TBK1免疫耐受效应的一种机制。因此，TBK1既能抑制免疫反应，又能促进肿瘤进展 13，但TBK1在髓样细胞中的表达，特别是胶质瘤微环境髓样细胞中的表达特征尚不明确。TCGA、CG G A 和GTEx等数据库显示TBK1在低级别胶质瘤和胶质母细胞瘤GBM中的表达与正常脑组织相比显著升高。TBK1低表达的胶质瘤患者与TBK1高表达的胶质瘤患者相比,生存时间相对较长 14。最近研究发现TBK1作为一种免疫逃避基因，靶向TBK1可以降低效应细胞因子（肿瘤坏死因子/干扰素，TNF/IFN）的细胞毒性阈值，从而增强对程序性死亡受体1（programmed cell death protein1，PD-1）阻断的反应，表明TBK1是一种有效的克服癌症免疫治疗耐药的新靶点。研究者发现抑制TBK1联合抗PD-1处理组肿瘤浸润性髓系细胞的亚组分析显示M1巨噬细胞数量显著增加，而一些免疫抑制髓系细胞群数量减少，包括髓系来源的抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，M D SCs)。证实了抑制TBK1对骨髓源性细胞免疫表型的重要调控作（收稿日期：2 0 2 3-0 6-16）686脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期用，进而重塑肿瘤免疫微环境15。本研究中高级别胶质瘤肿瘤组织中CD11b+细胞TBK1总蛋白表达水平较瘤旁组织明显增多，提示髓样细胞中TBK1可能参与胶质瘤进展。进一步研究发现,与瘤旁组织相比，肿瘤组织中p-TBK1蛋白水平明显升高，且p-TBK1的表达与CD68+巨噬细胞有共定位，提示p-TBK1在高级别胶质瘤微环境巨噬细胞的免疫表型可能有一定调控作用，与文献报道一致。招募到脑部的肿瘤浸润性髓样细胞主要来源于血液单核细胞。单核细胞作为重要的固有免疫细胞，具有明显的异质性，通常根据细胞表面标记CD14和CD16表达水平，分为经典型（CD14+CD16-）、中间型（CD14*CD16+）和非经典型（CD14CD16+）亚群。有研究报道经典单核细胞（CD14+CD16）亚群与促进肿瘤发生和癌症转移有关 16 。经典型亚群在胶质瘤患者外周血单核细胞所占比例最多，而非经典单核细胞仅占一小部分 17 。本研究中，高级别胶质瘤患者术前和术后外周血经典单核细胞亚群的比例未发生明显变化。与文献报道一致 17，经典单核细胞仍占主要比例。进一步分析患者术前、术后经典单核细胞中p-TBK1的表达变化，初步发现术后患者外周血经典单核细胞中p-TBK1的表达较术前明显降低，这可能是由于术前胶质瘤患者存在免疫抑制的肿瘤微环境，免疫功能受到抑制，而经手术治疗后肿瘤免疫微环境发生改变，免疫抑制作用减弱，因而参与调节免疫抑制的p-TBK1的蛋白表达水平也相应降低。本研究初步探讨了TBK1在脑胶质瘤患者瘤旁和肿瘤组织髓样细胞中的表达，以及术前、术后外周血经典单核细胞中p-TBK1的表达变化，为明确髓样细胞TBK1在脑胶质瘤中的作用及机制提供实验依据。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突作者贡献声明李媛媛、纪乐、张劭然、李忠尧：实验操作、资料收集和整理、论文撰写；李春岩、刘亚坤：论文指导和审阅参考文献1 Buonfiglioli A,Hambardzumyan D.Macrophages and microglia:thecerberus of glioblastomaJJ.Acta Neuropathol Commun,2021,9(1):54.2Barberi T,Martin A,Suresh R,et al.Absence of host NF-k B p50induces 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