不同脱脂方法对高脂肪型复杂食物基质中牛乳过敏原检测的影响.pdf
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1、第 41 卷 第 6 期2023 年 11 月食 品 科 学 技 术 学 报Journal of Food Science and TechnologyVol.41 No.6Nov.2023doi:10.12301/spxb202200765文章编号:2095鄄6002(2023)06鄄0115鄄12引用格式:胡巍,杨帆,熊子奕,等.不同脱脂方法对高脂肪型复杂食物基质中牛乳过敏原检测的影响J.食品科学技术学报,2023,41(6):115-126.HU Wei,YANG Fan,XIONG Ziyi,et al.Effects of different degreasing methods o
2、n cow蒺s milk allergens detection in high鄄fatcomplex food matrixJ.Journal of Food Science and Technology,2023,41(6):115-126.不同脱脂方法对高脂肪型复杂食物基质中牛乳过敏原检测的影响胡摇 巍1,2,3,摇 杨摇 帆1,2,3,摇 熊子奕1,2,3,摇 高金燕2,3,摇 陈红兵1,3,4,摇 李摇 欣1,2,3,*(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌摇 330047;2.南昌大学 食品学院,江西 南昌摇 330047;3.江西省食物过敏重点实验室,江西 南昌
3、摇 330047;4.南昌大学 中德联合研究院,江西 南昌摇 330047)摘摇 要:脂肪作为食品的常见成分,会与牛乳过敏原蛋白之间发生相互作用从而影响过敏原蛋白的提取效果和检测准确性。然而,有关高脂肪型复杂食物基质的脱脂方法仍鲜有研究。以含有牛乳过敏原的巧克力模拟高脂肪型复杂基质,分别测定了正己烷、异丙醇、乙酸乙酯和脂肪酶脱脂处理后模拟基质的脱脂率和蛋白损失率,比较了脱脂前后蛋白结构、粒度、脂肪分布和微观结构的变化,同时利用间接 ELISA 测定脱脂前后从模拟基质中主要牛乳过敏原的含量。结果表明:正己烷的脱脂率最高且蛋白损失率最低,分别为 87郾 87%和 6郾 86%;脱脂会改变蛋白质的空
4、间结构,整体由紧凑变为松散,其中正己烷组和乙酸乙酯组的变化较小。粒径在脱脂后略微降低,但异丙醇处理会使蛋白聚集成较大的颗粒,粒径由297郾 9 nm 升高至445郾 1 nm。正己烷和乙酸乙酯脱脂后模拟基质的脂肪分布更为均一且液滴变小,表面形貌由致密光滑的块状变为疏松多孔结构;而异丙醇组和脂肪酶组仍然存在部分结块。间接 ELISA 结果表明:酪蛋白在乙酸乙酯组中的提取率提升了61郾 02%;琢鄄乳白蛋白和 茁鄄乳球蛋白在正己烷处理后的提取质量浓度最高,分别为 0郾 73 mg/mL 和1郾 89 mg/mL。正己烷脱脂处理可以明显改善高脂肪复杂基质中过敏原的提取效果,希望研究结果可为实现高脂肪
5、型复杂食物基质中过敏原的准确检测提供参考。关键词:过敏原检测;复杂食物基质;牛乳过敏原;脱脂处理;高脂肪型食物中图分类号:TS201郾 6摇 摇 摇 摇 摇 文献标志码:A收稿日期:20220801基金项目:国家自然科学基金资助项目(31872887)。Foundation:National Natural Science Foundation of China(31872887).第一作者:胡摇 巍,女,硕士研究生,研究方向为食物过敏。摇*通信作者:李摇 欣,女,教授,博士,博士生导师,主要从事食物过敏方面的研究。摇 摇 牛乳是八大类过敏食物之一,其营养丰富1。牛乳中含有 30 多种潜在的过
6、敏原蛋白,其中酪蛋白、琢鄄乳白蛋白和 茁鄄乳球蛋白是牛乳中的主要过敏原2。尽管过敏原标签的使用有效地提高了消费者获取过敏原信息的便利性,但是现行的标签法规仍不能消除食品中隐藏的过敏原所引起的潜511在危险。因此,实现食物过敏原的准确检测是保障食用安全的重要前提。食物样品的前处理方法是过敏原检测的重要环节,采用不同方法直接影响到检测的准确性,并与过敏原的丰度、含量和免疫反应性有关3。食物基质成分易于与过敏原形成共价键、离子键、氢键或疏水相互作用从而影响其检测结果4。巧克力是相对复杂的食品基质之一,原料乳粉中包含的乳蛋白是其主要的过敏物质,其中含有的大量脂肪可能会在调温期间影响产品的结晶从而掩蔽部
7、分过敏原表位5。此外,样品制备过程中脂肪的存在会阻碍过敏原蛋白的分离提取或影响抗原抗体反应从而降低检测的准确度6。因此,开发适用于高脂肪型食物脱脂的前处理方法迫在眉睫。然而直至目前,这类研究仍鲜有报道。化学溶剂法和脂肪酶法作为食物中常见的脱脂方法,被广泛应用于样品的前处理中7-8。溶剂法常使用烷烃、醇和酯类等有机试剂溶解并分离脂肪9,脂肪酶法通过使酯键水解断裂,将脂肪转化成较易从蛋白质中分离出来的脂肪酸和甘油10。然而,溶剂和酶均可能改变蛋白质的结构和性质,导致过敏原的致敏性发生变化。崔岩岩等11使用溶剂法对椰子粕进行脱脂处理,发现脱脂溶剂破坏了椰子分离蛋白亚基的二硫键,同时通过破坏蛋白分子间
8、的疏水键使其三级结构展开。耿勤12发现脂肪酶脱脂会改变米渣蛋白的三级结构并使其溶解性降低。蛋白质结构影响着过敏原的致敏性,结构变化的过程中其表位的含量和暴露情况也可能随之变化。因此,脱脂效果好、过敏原提取率高且对过敏原结构影响较小的脱脂方法是目前高脂肪型复杂食物基质前处理的研发重点。本研究选用含有牛乳过敏原的巧克力作为高脂肪型食物基质模型,分别利用正己烷、异丙醇和乙酸乙酯等脱脂剂和脂肪酶对样品进行脱脂处理,比较了不同脱脂方法对样品脱脂率、蛋白损失率、粒度、蛋白结构、脂肪分布情况和微观结构的影响。此外,利用间接 ELISA 定量脱脂前后样品中主要牛乳过敏原的浓度,依据实验结果为 3 种牛乳过敏原
9、分别确定一种较优的脱脂方法,以期有效提升高脂肪型复杂食物基质中牛乳过敏原的提取效果,最终达到提升检测准确度的目的。1摇 材料与方法1郾 1摇 材料与试剂乳粉,恒天然商贸上海有限公司(由纯牛乳喷雾干燥获得,蛋白质质量分数 24%);可可粉,太古糖业(中国)有限公司;可可脂,法国可可百利公司;正己烷、异丙醇、乙酸乙酯均为色谱纯,德国 Meker公司;食品脂肪酶(活力值50 000 U),安徽绿微康生物科技有限公司;牛血清白蛋白(bovine serum albu鄄min,BSA)、预染大分子蛋白质 Marker、考马斯亮蓝R250、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacet
10、icacid,EDTA)、8鄄苯胺鄄1鄄萘磺酸(8鄄anilino鄄1鄄naphtha鄄lenesulfonic acid ammonium salt,ANS)、羊抗兔 lgG抗体,美国 Sigma 公司;尼罗红染色剂,北京索莱宝科技有限公司;3,3忆,5,5忆鄄四甲基联苯胺(3,3忆,5,5忆鄄tetramethylbenzidine,TMB),欣博盛生物科技有限公司;兔抗 琢鄄乳白蛋白、兔抗 茁鄄乳球蛋白和兔抗酪蛋白血清为实验室自制。其他常用生化试剂均为分析纯。1郾 2摇 仪器与设备SZC-101S1 型脂肪测定仪,上海纤检仪器有限公司;XCell4 SureLock 中型胶电泳槽,美国
11、Bio-RAD 公司;TU-1901 型紫外分光光度计,北京普析通用仪器公司;F-4600 型荧光分光光度计、Regulus8100 型冷场发射扫描电镜,日本 Hitachi 公司;Vari鄄oskan LUX 型多功能酶标仪,美国 Thermo 公司;BI-200SM 型动静态光散射仪,美国 Brookhaven 公司;Leica TCS SP8 型激光共聚焦显微镜,德国 Laica公司。1郾 3摇 实验方法1郾 3郾 1摇 模拟高脂肪型复杂食物基质的制备巧克力食品模型较多,为了保障配方的稳定性,参考文献报道的基础模型并进行调整得出最终模型13,乳粉 60 g,可可脂 70 g,白砂糖 20
12、 g。原材料混合均匀后在 60 益 下融化并搅拌,于 45 益 精炼1 h,随后在 27 29 益进行调温,放入冰箱 4 益冷却凝固 2 h。1郾 3郾 2摇 脱脂处理方法1)溶剂法。将样品和脱脂剂加入离心管中,恒温 37 益磁力搅拌 2 h,获得的处理液在 8 000 g 下离心 10 min,弃去上清,于通风橱内干燥并挥发溶剂,611食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月收集粉末状样品备用。2)酶法。向磷酸盐缓冲液(phosphate buffered sa鄄line,PBS)中加入脂肪酶以获得质量浓度为0郾3 g/L 的脱
13、脂酶液,样品预热后加入酶液进行水解,于 50 益下搅拌90 min。之后采用95 益水浴加热处理10 min 使酶灭活,于冷水浴中迅速冷却,冻干成粉末状。1郾 3郾 3摇 脱脂率的测定参考罗舜菁等14的方法并稍加修改。称取 2 g左右样品,转入在底部已塞脱脂棉的滤纸筒内,再用脱脂棉塞入上部压住试样,放入专用铝杯中,于脂肪测定仪中进行脂肪量的测定。设置浸泡、抽提、回收、烘干 4 个阶段的温度和时间,55 益浸泡1郾 5 h,75 益抽提1郾 5 h,85 益溶剂回收15 min,烘干阶段设为110 益45 min。称量测定前后铝杯的质量差以获得脂肪质量,脱脂率的计算见式(1)。脱脂率=w0-w1
14、w0伊100%。(1)式(1)中,w0为脱脂前样品脂肪体积分数,g/100g;w1为脱脂后样品脂肪体积分数,g/100g。1郾 3郾 4摇 蛋白损失率的测定采用 Bradford(考马斯亮蓝)法测定脱脂处理后模拟基质中蛋白质的损失率。本研究将 BSA 设置为标准蛋白,配制不同浓度的标准蛋白溶液。向 96孔酶标板中每孔加入 20 滋L 待测样品和 200 滋L 考马斯亮蓝 G-250 溶液混匀,避光放置 10 min,于595 nm 处测定其吸光度值,绘制蛋白质浓度标准曲线,从而计算出样液的蛋白质浓度,蛋白损失率的计算见式(2)。蛋白损失率(=1-籽1籽)0伊100%。(2)式(2)中,籽0为脱
15、脂处理前蛋白质量浓度,mg/mL;籽1为脱脂处理后蛋白质量浓度,mg/mL。1郾 3郾 5摇 蛋白质分子质量的测定采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(so鄄dium dodecyl sulfate鄄polyacrylamide gel electrophore鄄sis,SDS-PAGE)对脱脂处理后模拟基质中的蛋白质分子质量进行鉴定分析。每孔上样 8 滋L。电泳条件设置为:电流 12 mA(浓缩胶)和 24 mA(分离胶)。考马斯亮蓝 R-250 染色 15 min,染色结束用冰醋酸-甲醇溶液进行脱色。1郾 3郾 6摇 蛋白质结构的测定1郾 3郾 6郾 1摇 圆二色谱分析参考操强等15的研究
16、方法采用圆二色谱仪测定蛋白质的二级结构变化。比色皿厚度为 1 mm,波长范围为 190 240 nm,速度为 100 nm/min,在室温及连续吹入氮气条件下检测,样品扫描 3 次取其平均值,通过差减除去空白基线信号值,再使 用Dichroweb 网站计算蛋白二级结构含量。1郾 3郾 6郾 2摇 内源性荧光光谱分析参考 Gao 等16的研究方法采用荧光分光光度计测定蛋白质的三级结构变化。设定荧光分光光度计的条件为:激发波长(姿ex)为 280 nm,发射波长(姿em)为300 450 nm,光步 5 nm,测试时间为 200 ms,狭缝宽度为5郾 0 nm,对样品的荧光强度进行扫描。1郾 3郾
17、 6郾 3摇 三维荧光分析采用荧光分光光度计测定蛋白质的高级结构变化。当激发波长(姿ex)范围为 200 400 nm,发射波长(姿em)范围为 200 600 nm 时,两者都以 5 nm 为间距增加,采集荧光信号得到激发发射矩阵荧光光谱,即三维荧光光谱。1郾 3郾 7摇 蛋白质表面疏水性的测定本研究以 ANS 荧光探针法测定蛋白质的表面疏水性差异17。室温下以 1颐 50 的比例向样品中加入 5 mmol/L ANS 溶液,避光反应 1 h 后使用荧光分光光度计检测荧光强度,激发波长(姿ex)为390 nm,发射波长(姿em)为 400 600 nm,扫描速度为1 200 nm/min,狭
18、缝宽度为 5郾 0 nm。1郾 3郾 8摇 脂肪分布的测定使用激光共聚焦显微镜观察测定模拟基质的脂肪分布,参考谢安琪等18的方法并稍加修改。取1 mL样品加入20 滋L 质量浓度为0郾 01 g/L 的尼罗红染料并混合均匀,避光放置 30 min。将样品均匀涂布于载玻片上并固定在激光共聚焦显微镜载物台上,20 倍物镜,设置激发波长为 488 nm,并采集荧光图像。1郾 3郾 9摇 模拟基质粒度的测定参考 Xie 等19的研究方法,采用动静态光散射表征模拟基质的平均粒径大小并比较粒径分布的情况。1郾 3郾 10摇 模拟基质微观结构的测定参考步营等20的方法测定模拟基质的微观结711第 41 卷
19、第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 胡摇 巍等:不同脱脂方法对高脂肪型复杂食物基质中牛乳过敏原检测的影响构。蘸取少量脱脂前后的样品粉末均匀涂布于导电胶上,并将导电胶贴合在置物台上,将附有样品的置物台放在冷场发射扫描电镜下进行观察,电压设置为 5 kV。1郾 3郾 11摇 牛乳过敏原质量浓度的测定参考本团队先前建立的间接 ELISA 方法21并稍加修改,测定模拟基质中牛乳过敏原的浓度。分别以 琢鄄乳白蛋白、茁鄄乳球蛋白、酪蛋白和稀释一定倍数的待测样品作为包被抗原,兔多克隆抗体作为一抗,辣根过氧化物 酶(horseradish peroxi鄄dase,HRP)标记的羊抗兔 IgG 作为二抗。琢鄄乳白
20、蛋白:将 琢鄄乳白蛋白用 PBS 梯度稀释至 0郾 031 25、0郾 062 5、0郾 125、0郾 25、0郾 5 滋g/mL 进行抗原包被,兔抗 琢鄄乳白蛋白血清稀释倍数为1颐 160 000,绘制琢鄄乳白蛋白的定量标准曲线。茁鄄乳球蛋白:将 茁鄄乳球蛋白用 PBS 梯度稀释至 0郾 156 25、0郾 312 5、0郾 625、1郾 25、2郾 5 滋g/mL 进行抗原包被,兔抗 茁鄄乳球蛋白血清稀释倍数为 1颐 160 000。酪蛋白:将酪蛋白用 PBS 梯度稀释至 0郾 125、0郾 25、0郾 5、1郾 0、2郾 0 滋g/mL 进行抗原包被,兔抗酪蛋白血清稀释倍数为 1颐 10
21、 000。1郾 4摇 数据处理每组实验重复3 次并取平均值,采用 SPSS 24郾 0进行差异显著性分析,认为 P 0郾 05 时为具有显著性差异,采用 Origin 9郾 0 进行图形绘制。2摇 结果与分析2郾 1摇 脱脂方法对模拟基质脱脂率和蛋白损失率的影响不同脱脂方法处理后样品的脱脂率和蛋白损失率见图 1。由图 1 可知,4 种脱脂方法的脱脂率由优到差依次为正己烷、乙酸乙酯、脂肪酶、异丙醇。正己烷和乙酸乙酯的脱脂率均超过 80%,其中正己烷脱脂率高达 87郾 87%。此外,脱脂处理后模拟基质中的蛋白质均出现不同程度的损失,其中正己烷对蛋白质含量的影响最小,损失率为 6郾 86%,异丙醇影
22、响最大,损失率超过 30%。2郾 2摇 脱脂方法对模拟基质中蛋白质分子质量的影响不同脱脂方法处理后模拟基质中乳蛋白的SDS-PAGE 电泳结果见图 2。由图 2 可知,样品主要存在 4 条蛋白条带,分子质量依次位于 35、25、摇 摇 对照组为未经脱脂处理的巧克力样品,不同小写字母表示组间数据差异显著(P 0郾 05)。图 1摇 脱脂方法处理后模拟基质的脱脂率和蛋白损失率Fig.1摇 Degreasing rate and protein loss rate of simulatedmatrix treated with different degreasing methods摇15、10 k
23、Da 左右。这与预测的结果一致,巧克力中只含有乳蛋白,在 25 35 kDa 的是牛乳中含量最高的酪蛋白,分别位于15 kDa 和10 kDa 上方的是分子质量为 18郾 3 kDa 的 茁鄄乳球蛋白和14郾 2 kDa 的琢鄄乳白蛋白。脱脂前后样品中蛋白的组分和分子质量大小无显著变化,表明 4 种脱脂处理方法对样品中主要的牛乳过敏原蛋白的一级结构未产生影响。摇 摇 对照组为未经脱脂处理的巧克力样品。泳道 M:蛋白Marker;泳道 1:对照组;泳道 2 5:正己烷组、异丙醇组、乙酸乙酯组和脂肪酶组。Casein:酪蛋白;ALA:琢鄄乳白蛋白;BLG:茁鄄乳球蛋白。图 2摇 脱脂处理后模拟基质
24、中蛋白质的 SDS-PAGEFig.2摇 SDS-PAGE of proteins in simulatedmatrix after degreasing treatment摇2郾 3摇 脱脂方法对模拟基质中蛋白质结构的影响2郾 3郾 1摇 圆二色谱分析结果圆二色性光谱广泛应用于蛋白质构象研究领域。对不同脱脂方法处理前后蛋白质的圆二色性光811食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月谱进行分析,结果见图 3 和表 1。由图 3 和表 1 可知,在190 240 nm 的波长范围内,190 nm 处的正峰和 208、220 nm 处
25、的负峰是 琢鄄螺旋的特征峰,而195 nm 左右的正峰和 217 nm 左右的负峰是 茁鄄折叠的特征峰。整体来看,脱脂处理改变了蛋白质的二级结构。和对照组相比,溶剂法脱脂处理后样品蛋白的 琢鄄螺旋含量均降低,正己烷、异丙醇和乙酸乙酯组分别降低了 56郾 8%、88郾 1%和 34郾 7%。异丙醇组 茁鄄转角含量降低 41郾 8%,茁鄄折叠和无规则卷曲含量分别升高了 2郾 4 和 1郾 5 倍。研究发现,氢键与二级结构含量的变化密切相关22,脱脂溶剂中大多含有羟基、酯键、大量的氧原子和氢原子,可能与蛋白质发生相互作用从而改变了二级结构中氢键的顺序和排列模式,出现了大量反平行 茁鄄折叠聚集体23。
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