不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证.pdf
《不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证.pdf(12页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、浙江农业学报 ():/.刘方程 王峰 毕冬琳 等.不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证.浙江农业学报 ():.:/.收稿日期:基金项目:国家自然科学基金()西北民族大学中央高校基本科研业务费项目()甘肃省教育厅高等教育教学成果培育项目()西北民族大学教学改革研究项目()作者简介:刘方程()男甘肃兰州人硕士研究生从事病毒天然免疫机制研究:.通信作者李琼毅:.不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证刘方程王 峰毕冬琳杨东亮杨晓莉柏家林李琼毅(西北民族大学.生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室.生命科学与工程学院甘肃 兰州)摘 要:兔出血症是由兔出血症病毒()引起的一种兔急性、高度致
2、死性传染病成年兔死亡率超过 但 周龄幼兔不发病 基于幼年兔与成年兔对 的易感性差异采用串联质谱标记()蛋白质组学技术对幼年兔(周龄)和成年兔(月龄)肝中的蛋白质进行检测和定量分析从幼年兔和成年兔肝中定量获得 个蛋白质筛选出 个差异蛋白质相较于幼年兔成年兔肝中 个蛋白质显著上调 个蛋白质显著下调 功能富集分析结果显示生物学过程主要富集到 个小分子代谢蛋白质、个与氧化还原过程相关的蛋白质和 个参与代谢过程的蛋白质细胞组分主要富集到 个细胞外成分蛋白质、个线粒体蛋白质和 个细胞质蛋白质等分子功能主要富集到 个催化活性蛋白质、个氧化还原活性蛋白质和 个辅酶结合蛋白质等 个差异蛋白质在 数据库中共注释到
3、 条 信号通路主要涉及代谢途径、糖代谢、氧化磷酸化作用和剪切小体等通路 幼年兔和成年兔肝中差异蛋白质互作网络分析发现 的关联度最高且差异蛋白质胆固醇酰基转移酶()在互作网络中具有更多相互作用关系 从蛋白质水平探讨幼年兔和成年兔的感染差异机制筛选并分析幼年兔和成年兔肝中的差异蛋白质筛选出的差异蛋白质有望成为 体外扩增细胞系构建的突破点为构建适宜 体外扩增的细胞系提供新的研究思路关键词:新西兰兔 蛋白质组学兔出血症病毒()肝差异蛋白质中图分类号:文献标志码:文章编号:()(.):().()()().().().:()()兔出血症病毒()是兔出血症()的病原体又名兔瘟 年我国首次报道了兔出血症的流行
4、在之后的 个月内中国约有 亿只家兔因兔出血症死亡该疾病在短时间内传播到约 万 的区域并且在接下来的 年里该病毒在全球范围内传播严重威胁世界范围内养兔业的发展 成熟 为单股正链 病毒呈球形直径约 无包膜表面有典型的杯状凹陷 基因组全长约 含有 个重叠的开放阅读框()编码病毒主要结构蛋白 和 个非结构蛋白、解旋酶、蛋白酶和 依赖的 聚合酶()则编码次级结构蛋白 根据 基因组序列 可分为 和 两个基因群:包括.共 种基因型其中.()和.()是兔感染 的主要病原体.和.无致病性包括欧洲棕兔综合征病毒()和与 相关的非致病性兔杯状病毒()成年兔对.型 易感死亡率达以上但 月龄幼兔感染后发病率较低 周龄幼
5、兔不发病 幼兔对 的易感性随年龄的增加而增加直到 周龄其发病率、死亡率与成年兔一样 幼兔对.型 的天然抗病机制尚不明确但可能与幼兔和成年兔肝结构功能不同 及固有免疫应答差异相关 目前由于没有适宜体外复制增殖的细胞系 致病机制等相关研究进展缓慢正因为幼兔对其存在天然抵抗性故寻找并分析关键的差异蛋白质对 易感性的影响将为其致病机制研究和疫苗研发带来新突破 本文运用串联质谱标记()定量蛋白质组学技术和生物信息学分析对 周龄幼年兔和 月龄成年兔肝中差异蛋白质进行分析旨在从蛋白质水平阐明成年兔和幼年兔对 易感性差异的分子机制为研究 易感染宿主细胞的潜在靶点和 体外扩增细胞系的构建提供新的思路和方法 材料
6、与方法 试验材料未接种 疫苗的 周龄幼年和 月龄成年新西兰兔各 只购自甘肃省水思圆智能科浙江农业学报 第 卷 第 期技工程有限公司 将兔用空气栓塞法处死解剖采集肝组织切成 大小方块用锡箔纸包裹于 保存备用 兔肾细胞系 购自武汉大学中国典型培养物保藏中心()分子标记试剂盒、蛋白质定量试剂盒、乙醇、甲酸、乙腈、丙酮、纳升级肽段分析柱()和 兔单克隆抗体均购自美国赛默飞世尔科技公司羟乙基哌嗪乙磺酸()、十二烷基硫酸钠()、三氟乙酸()和甲酸铵均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司乙二胺四乙酸()、蛋白酶抑制剂()、二硫苏糖醇()、碘乙酰胺()和测序级胰蛋白酶()购自上海普洛麦格生物产品有限公司三乙
7、基碳酸氢铵()和 氨水购自上海圣克鲁斯生物技术有限公司 除盐柱()和高 反相色谱柱均购自上海沃特世有限公司尿素购自美国英杰生物技术有限公司 鼠单克隆抗体、鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、兔单克隆抗体和 鼠单克隆抗体均购自 公司 兔单克隆抗体、山羊抗鼠 和山羊抗兔 购自上海睿铂赛生物科技有限公司 高敏 发光底物购自北京四正柏生物科技有限公司磷酸缓冲盐液(值 )、电转液、裂解液和 缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司 蛋白质提取、酶解将 保存的肝组织研磨后加入 裂解液放于冰上超声破碎 、离心 取上清液使用 蛋白质测定试剂盒对蛋白质进行定量检测 吸取 蛋白质溶液添加 三乙基碳酸氢铵()至 加入二硫苏糖醇()
8、至终浓度为 还原 加入碘乙酰胺()至终浓度 室温避光孵育 加入预冷丙酮沉淀蛋白质离心收集沉淀加入 丙酮、乙醇溶液混悬沉淀 沉淀 以上离心、收集沉淀加入 溶液复溶沉淀加入胰蛋白酶 反应 酶解蛋白质悬浮液 肽段标记根据 分子标记试剂盒说明书对每个样品肽段进行标记将 试剂溶于 异丙醇取 样品肽段加入已溶解的 试剂于室温下反应 后加入 超纯水终止反应随后将样品离心真空冷冻干燥 标记肽段除盐将标记后的干燥样品溶于 、乙腈溶液使用 、乙腈活化除盐柱加入 、乙腈溶液平衡除盐柱将重溶样品加入除盐柱内使样品缓慢流过除盐柱标记肽段被除盐柱捕集盐和其他非疏水性小分子流出、舍弃 再添加 、乙腈溶液清洗除盐柱洗去残留盐
9、类 添加 、乙腈溶液使液体缓慢流过除盐柱将肽段洗脱下来使用新 管收集洗脱溶液 最后将洗脱溶液冷冻干燥去除乙腈 反相色谱分离与质谱用 公司的 超高效液相色谱系统进行分离高 流动相 为 值 的 甲酸铵高 流动相 为 值 的 甲酸铵、乙腈色谱柱为超高效色谱柱()上样量 流速 紫外光谱检测 结束色谱分离后用 质谱分析肽段 离子源喷雾电压为 质谱仪加热毛细管设定温度为 采用数据依赖模式自动在 和/间切换采集条件设置:最大进样时间 全扫描分辨率 /分辨率 母离子扫描范围 /碰撞能量 蛋白质鉴定和定量检测将质谱数据输入到 ()软件()后软件先对质谱图进行筛选 软件提取后的谱图用 ()进行搜索搜索结束后 软件
10、根据 搜索结果和质谱图进行定量分析 蛋白质组学原始数据库已通过 存储库存入国际蛋白质组学共享联盟()项目 号为 刘方程 等.不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证 生物信息学分析 功能注释使用 软件和 数据库(:/./)对筛选出的差异蛋白质进行搜索然后利用 进行定位和注释 通路注释将筛选出的差异蛋白质在京都基因与基因组百科全书 数据库()(./.)进行对比对目标蛋白质进行 归类并获取目标蛋白质序列参与的通路信息 蛋白质互作网络()分析利用(:/./.)和(:/./)数据库查找差异蛋白质之间的直接和间接相互作用关系 使用 软件进一步分析功能性蛋白质相互作用网络并计算每种蛋白质的丰度以评估蛋白质
11、在网络中的重要性构建差异蛋白质的网络互作图 差异蛋白质 验证收集生长状态良好的 细胞、成年家兔和幼年家兔肝组织用(含 蛋白酶抑制剂)裂解液裂解制备好的蛋白质样品分别加入 胶上样孔中每孔上样量为 设置恒压 电泳 电泳完成后用伯乐半干转膜仪、条件下转膜 转印至 膜 用脱脂奶粉封闭 后加入差异蛋白质单克隆抗体 孵育过夜用 洗膜 次加入 标记的二抗室温孵育 用 洗膜 次用电泳凝胶成像分析系统显色 数据分析对筛选得到的差异蛋白质进行 检测检测结果采用()软件进行灰度分析其余数据均使用 软件进行多组间单因素方差分析()分析 结果与分析 差异蛋白质的筛选与鉴定本试验共鉴定了 个蛋白质筛选出 个具有统计学意义
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 不同 月龄 新西兰 兔肝中 差异 蛋白质 鉴定 验证
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。