不同个体来源和低氧条件对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.pdf
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1、中国医药生物技术 2023 年 10 月第 18 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol,October 2023,Vol.18,No.5 393 DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2023.05.002 论著 不同个体来源和低氧条件 对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响 孙雪飞,李静颐,陈媛,姜茜茜,张玲玲,王琳,刘元波 【摘要】目的 研究 6 株不同个体(男:M1、M2、M3;女:F1、F2、F3)来源人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)在不同低氧条件下生物学特性的差异。方法 流式及诱导分化实验鉴定间充质干细胞的标志物表达及三系分化能力。Transwel
2、l 法检测迁移能力。CCK8 法检测 5%及 1%氧气下细胞活力差异。结果 6 株 BM-MSC 阳性标志物表达均高于 99%,阴性标志物总表达均低于 2%,且均具有三系分化能力。不同个体来源 BM-MSC 成骨、成脂分化效率和细胞活力具有差异,性别分层统计显示成脂分化差异可能与性别相关;不同低氧条件下 BM-MSC 的细胞活力和细胞迁移能力具有差异,5%氧气条件显著优于 1%氧气条件。同时考虑氧气和性别因素时,发现不同低氧条件下男性来源的 BM-MSC 活力相对女性均具有较高的趋势,而迁移能力则是女性来源的 BM-MSC 相对更强。结论 提示应根据人骨髓间充质干细胞的应用目的所需特性对供者个
3、体和扩增环境设立特定标准。【关键词】人骨髓间充质干细胞;低氧;性别;细胞活力 中国医药生物技术,2023,18(5):393-401 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是多组织来源的一种具有多向分化潜能的干细胞,可从脐带、胎盘、羊膜、脂肪、牙髓、骨髓等组织中获取1。由于 MSC 具备较低的免疫原性且具有组织修复、免疫调节、炎症调节等多种特性,因此在再生与康复医学中占有重要地位2。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSC)由于方便取材、易于转染、免疫原性低而广泛应用于治疗心血管病、肺病、
4、免疫疾病、神经系统疾病等3。BM-MSC 在解决医疗领域的各种严重健康问题方面显示出巨大潜力4,推进骨髓间充质干细胞进入临床已成为趋势,目前针对 BM-MSC 的研究 大多集中在疗效、机制及不良反应方面,对于有助于 BM-MSC 成品化的药学研究探讨较少。药学开发包括起始原材料控制和生产工艺的开发。但作为关键的起始原材料,骨髓来源的供者目前尚无细胞特性相关的筛选标准,培养条件对细胞特性的影响也尚需更多研究。因此本研究通过对比不同个体来源和低氧条件下 BM-MSC 的生物学特性,初步评估个体和环境因素对细胞的影响。BM-MSC 在机体内通过多种机制发挥作用,包括免疫调节、炎症调节、旁分泌等5,并
5、且能够定向迁移至机体特定损伤部位。有多项研究报道,低氧条件(5%)相对常氧条件(20%)可提升 MSC 迁移能力6-7,但很少有研究对比超低氧(1%)及低氧(5%)条件下 MSC 活力和迁移能力的差异。此外,MSC 的扩增能力直接影响干细胞药物规模化生产,因此在保证 MSC 迁移能力的基础上探索最适宜的培养条件对于 MSC 作为药品进行量产扩增至关重要。本研究对不同个体来源的 BM-MSC 进行间充质干细胞特性鉴定,探讨不同低氧条件下不同个体来源 BM-MSC 生物学特性、细胞活力及迁移能力的差异,为 BM-MSC 的质量影响因素研究提供更多参考。1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器 BM-
6、MSC 为九芝堂美科(北京)细胞技术有限公司产品;RPMI 1640 培养基购自 Gibco 公司;胎牛血清购自 Lonsera 公司;细胞活力检测试剂盒(CCK8)购自上海碧云天生物技术有限公司;成骨分化试剂盒、成脂分化试剂盒和成软骨分化试剂 作者单位:100070 北京,首都医科大学附属北京天坛医院血液科(孙雪飞、刘元波);102600 北京,九芝堂美科(北京)细胞技术有限公司(李静颐、陈媛、姜茜茜、张玲玲、王琳)通信作者:刘元波,Email: 收稿日期:2023-04-07 394 中国医药生物技术 2023 年 10 月第 18 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol,O
7、ctober 2023,Vol.18,No.5 盒购自 Stemcell 公司;茜素红染色试剂盒、油红染色试剂盒和阿尔新蓝染色试剂盒均购自美国 Sigma 公司;transwell 细胞培养皿购自广州洁特;DAPI 染液购自索莱宝公司;流式抗体:CD14-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-APC、IgG1-PE 均购自美国 R&D 公司;4%组织固定液购自北京索莱宝科技有限公司。三气培养箱、离心机和酶标仪为美国 Thermo 公司产品;流式细胞仪为美国 Beckman 公司产品;倒置荧光显微镜为 Leica 公
8、司产品;细胞计数仪为 Countstar 公司产品;超净台为 Esco 公司产品。1.2 方法 1.2.1 细胞培养 骨髓样本与 HBSS 混匀后加入到 1.077 kg/m3 Ficoll-paque 分离液中,500 g 离心 30 min。收集单核细胞层后,于 HBSS 中洗涤 1 次。洗涤后的沉淀重悬于间充质干细胞培养基(DMEM+10%FBS)中,在 37、5%CO2 条件下培养,24 h 后更换培养基,弃去未贴壁的细胞,每隔 3 4 天换液,倒置显微镜下观察细胞生长情况。约 70%融合度时采用 TrypLE 消化细胞。获取的细胞冻存 130 及以下条件。待获取不同供体细胞后,取出冻
9、存的细胞在 水浴锅中快速复苏后加入间充质干细胞培养基,500 g 离心 5 min。离心完成后弃上清,加入间充质干细胞培养基后混匀接种至 10 cm 细胞培养皿中培养,待培养到可供后续实验的数量时收获。1.2.2 表面标志物检测 分别用无菌 PBS 重悬 6 个来源的 BM-MSC,按照流式检测试剂盒要求加入抗体常温孵育 1 h 后离心去上清,PBS 清洗 2 遍后加入 PBS 重悬细胞并上机进行流式检测。1.2.3 成骨分化 将 6 株不同个体(男:M1、M2、M3;女:F1、F2、F3)来源的 BM-MSC 分别接种于六孔板,细胞长满后弃掉培养基,每孔加入 2 ml 分化试剂盒中的成骨分化
10、培养基,每 3 4 天更换一次培养基,分化培养 12 16 d 观察到骨基质形成,使用茜素红染色观察成骨分化情况并拍照记录。1.2.4 成脂分化 将 6 株不同个体来源的 BM-MSC 分别接种于六孔板,细胞长满后弃掉培养基,每孔加入 2 ml 分化试剂盒中的成脂分化培养基,每 3 4 天更换一次培养基,分化培养 12 16 d 观察到脂滴形成后使用油红染色观察成脂分化情况并拍照记录。1.2.5 成软骨分化 将 6 株不同个体来源的 BM-MSC 分别接种于 6 个 15 ml 离心管中,500 g 离心 5 min 后弃上清,将离心形成的细胞团留在离心管底部,加入 2 ml 分化试剂盒中的成
11、软骨分化培养基进行分化培养,每 3 4 天更换一次培养基,分化培养 14 18 d 将细胞团吸出,4%PFA 固定后进行冰冻切片,使用阿尔新蓝对冰冻切片染色观察成软骨分化情况并拍照记录。1.2.6 细胞迁移实验 在 24 孔板的实验孔中加入 500 l 间充质干细胞培养基。取 1 105 个 BM-MSC 细胞接种于 24 孔板的 transwell 培养板上层嵌入皿中,再加入 250 l 间充质干细胞培养基,保证上层嵌入皿浸没于培养基中。在低氧、超低氧条件下培养 4 h 后取出细胞培养板,弃掉嵌入皿及嵌入皿下层培养孔中的培养基,在培养孔中加入 400 l 细胞消化液,液面可触及嵌入皿底,消化
12、细胞 8 min 后弃嵌入皿,充分吹打消化液后取 20 l 与 20 l AOPI 染液 1:1 混合,使用细胞计数仪检测迁移的细胞数量。1.2.7 细 胞 活 力 检 测 分 别 取 6 个 来 源 BM-MSC 各 2500 个细胞接种于 96 孔板中,每孔加入 100 l 间充质干细胞培养基。每组 BM-MSC 均设 3 个平行。分别于接种后的第 24、48、72 h 向实验孔中加入 10 l CCK8 试剂,37 避光孵育 2 h 后使用酶标仪读取 450 nm 处的 OD 值,并根据 OD 值绘制 BM-MSC 的生长曲线。1.3 统计学处理 使用 Excel 2019 进行实验数据
13、汇总,使用 GraphPad Prism 9.0.0 进行统计分析与作图。数据均以 sx 表示,P 0.05 表示有统计学显著差异。所有数据的比较先进行正态性检验和方差齐性检验,再进行独立样本 t 检验。2 结果 2.1 细胞标志物的表达 使用流式细胞术对 6 株 BM-MSC 进行细 胞表面标记物检测,阳性标记物 CD73、CD90、CD105 在所有 6 株细胞中的表达均在 95%以上(图 1)。阴性细胞表面标志物 HLA-DR、CD14、CD19、CD34、CD45(CD14、CD19、CD34、CD45 检测结果合并用 CDM 表示),6 株 BM-MSC 阴性标记物表达均在 2%以下
14、(图 1)。中国医药生物技术 2023 年 10 月第 18 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol,October 2023,Vol.18,No.5 395 CD73 CD90 CD105 HLA-DR CDM M1 M2 M3 F1 F2 F3 图 1 BM-MSC 细胞表面标志物(M:男性;F:女性)Figure 1 Cell surface markers of BM-MSC(M:Male;F:Female)396 中国医药生物技术 2023 年 10 月第 18 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol,October 2023,Vol.18,No.5 茜素
15、红染色面积(%)Average area of alizarin staining(%)20 15 10 5 0 M F BA 油红染色面积(%)Average area of oil red(%)20 15 10 5 0 M F DC E 图 2 BM-MSC 三系分化潜能A:成骨分化茜素红染色(20);B:成骨分化效率对比;C:成脂分化油红染色(20);D:成脂分化效率对比;E:成软骨分化阿尔新蓝染色(20);M:男性;F:女性 Figure 2 Triple differentiation potential of BM-MSC A:Alizarin red staining for o
16、steogenic differentiation(20);B:Comparison of osteogenic differentiation efficiency;C:Oil red staining of adipogenic differentiation(20);D:Comparison of adipogenic differentiation efficiency;E:Alcian blue staining for chondrogenic differentiation(20);M:Male;F:Female 中国医药生物技术 2023 年 10 月第 18 卷第 5 期 C
17、hin Med Biotechnol,October 2023,Vol.18,No.5 397 2.2 细胞多向分化潜能 2.2.1 BM-MSC 的成骨分化潜能 分别诱导 6 株 BM-MSC 成骨分化,在分化第 14 天均可被茜素红染为橘红色(图 2A),表明 6 株 BM-MSC 均具有成骨分化潜能,符合间充质干细胞鉴定要求中的成骨分化。不同个体来源 BM-MSC 细胞 M1、M2、M3、F1、F2、F3 的茜素红染色面积分别为 0.542%、4.568%、8.737%、5.381%、1.270%、16.220%,显示成骨分化效率个体差异较大。男性与女性来源 BM-MSC 成骨分化茜素红
18、染色面积(图 2B)无显著差异(P=0.583)。2.2.2 BM-MSC 的成脂分化潜能 分别诱导 6 株 BM-MSC 成脂分化,在第 14 天分化成的脂细胞中的脂滴可被油红 O 染成红色。6 株 BM-MSC 在成脂分化后均可见脂滴积累(图 2C),表明 6 株 BM-MSC 均具有成脂分化潜能,符合间充质干细胞鉴定要求中的成脂分化。不同个体来源 BM-MSC 细胞 M1、M2、M3、F1、F2、F3 的油红染色面积分别为 11.368%、14.284%、16.379%、11.123%、8.013%、5.702%。不同性别来源 BM-MSC 成脂分化油红染色面积统计(图 2D)发现男性来
19、源 BM-MSC 染色面积有高于女性来源的趋势(P=0.0503)。2.2.3 BM-MSC 的成软骨分化潜能 分别诱导 6 株 BM-MSC 成软骨分化,在分化第 16 天进行阿尔新蓝染色,分化后的软骨细胞中的蛋白多糖基质可被阿尔新蓝染料染为蓝绿色。6 株 BM-MSC 在成软骨分化后均可被阿尔新蓝染为蓝绿色(图 2E),表明均具有成软骨分化潜能,符合间充质干细胞鉴定要求中的成软骨分化。OD 值 OD value 0.80.60.40.20 1 2 3 4 细胞培养时间(天)Cell culture time(d)图 3 不同低氧条件下 BM-MSC 细胞活力 Figure 3 Cell v
20、iability of BM-MSC under different oxygen conditions 2.3 不同低氧条件下 BM-MSC 的细胞活力 2.3.1 低氧条件对细胞活力影响 分别在超低氧(1%)、低氧(5%)条件下培养 6 株 BM-MSC,细胞接种后每 24 小时进行一次 CCK8 检测,通过 OD 值对比不同低氧条件下 BM-MSC 的生长情况(图 3)。BM-MSC 接种后前 2 天,生长曲线呈平缓上升,细胞处于缓慢生长状态,不同低氧条件下细胞活力差别不大,低氧条件下 BM-MSC 细胞活力略强。接种后第 3 天,细胞加快生长,低氧和超低氧条件下 BM-MSC 的 OD
21、 值分别为 0.542 0.169、0.457 0.138,低氧培养的 BM-MSC 活力强于超低氧组。2.3.2 性别条件对 BM-MSC 活力的影响 使用 CCK8 法在不同低氧条件下检测不同性别个体来源 BM-MSC 活力差异,结果见图 4。男性来源 OD 值 OD value OD 值 OD value 1.00.80.60.40.20 1 2 3 0.80.60.40.20 1 2 3 细胞培养时间(天)Cell culture time(d)A 细胞培养时间(天)Cell culture time(d)B 图 4 不同性别来源 BM-MSC 活力(A:低氧 5%;B:超低氧 1%;
22、M:男性;F:女性)Figure 4 Cell viability of BM-MSC from different genders(A:5%oxygen;B:1%oxygen;M:Male;F:Female)398 中国医药生物技术 2023 年 10 月第 18 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol,October 2023,Vol.18,No.5 BM-MSC 活力在不同低氧培养条件下均较女性来源的 BM-MSC 有更高的趋势。2.3.3 不同个体来源细胞活力对比 使用 CCK8 法检测 6 株不同个体来源 BM-MSC 的细胞活力。6 株细胞在不同氧气条件下的生长趋势一
23、致,均为前 2 天缓慢生长,第 3 天快速生长。比较而言,M1、M3、F3 接种后细胞活力相对较高,其中 M3 接种后细胞活力最高(图 5)。2.4 不同低氧条件对 BM-MSC 迁移能力的影响 2.4.1 低氧条件对迁移能力的影响 使用 transwell 法分别在超低氧和低氧条件下对 6 株 BM-MSC 进行培养,4 h 后对穿过嵌入皿底部的细胞进行消化和计数。低氧条件下 BM-MSC 迁移数量为(32760.0 14391.8)个,显著高于超低氧条件下的(18948.3 6074.6)个(P 0.0001)。2.4.2 性别对 BM-MSC 迁移能力的影响 超低氧条件下不同性别来源 B
24、M-MSC 迁移数量无显著差异(图 6A)。低氧条件下女性来源 BM-MSC 迁移数量为(41046.0 11021.2)个,显著高于男性来源的(24473.0 12812.7)个(P 0.001)。OD 值 OD value M1 M2 M3 F1 F2 F3 OD 值 OD value M1 M2 M3 F1 F2 F3 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1 2 3 1.00.80.60.40.20 1 2 3 细胞培养时间(天)Cell culture time(d)A 细胞培养时间(天)Cell culture time(d)B图 5 不同个体来源 BM-MSC 在不同低氧条件下的细
25、胞活力(A:1%超低氧;B:5%低氧;M:男性;F:女性;*表示与 M2 对比细胞活力具有显著性差异,*P 0.05,*P 0.01,*P 0.001;#表示与 F1 对比细胞活力具有显著性差异,#P 0.05,#P 0.01,#P 0.001;+表示与 F2 对比细胞活力具有显著性差异,+P 0.05,+P 0.01,+P 0.001;&表示与 F3 对比细胞活力具有显著性差异,&P 0.05,&P 0.01)Figure 5 Cell viability of BM-MSC from different individual sources under different oxygen c
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