SN∕T 5227.4-2019 出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法)(出入境检验检疫).pdf
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1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5227.42019出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法 (RAA法)Rapid detection of duck derived ingredient in food for exportReal-time recombinase-aid amplification (RAA) method2019-12-27 发布2020-07-01 实施ICS 67.050C 53中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 5227.42019I前 言SN/T 52272019出口食品中动
2、物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法) 分为 11 个部分:第 1 部分:出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) ;第 2 部分:出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) ; 第 3 部分:出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) ;第 4 部分:出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) ;第 5 部分:出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) ;第 6 部分:出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RA
3、A 法) ;第 7 部分:出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) ;第 8 部分:出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) ;第 9 部分:出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) ;第 10 部分:出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) ;第 11 部分:出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) 。本部分为 SN/T 52272019 的第 4 部分。本部分按照 GB/T 1.12009 的规则进行编写。本部分由中华人民共和国海关总署提
4、出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国北京海关、中国检验检疫科学研究院、中国动物卫生与流行病学中心、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国福州海关。本部分主要起草人:苗丽、汪琳、乔晴、邓婷婷、李阳、张九凯、徐淑菲、罗宝正、郑秋月、吴姗、孔繁德、郑晶。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 5227.42019出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链置换核酸扩增法(RAA 法)1 范围本部分规定了出口食品中鸭源性成分的 RAA 检测方法。本部分适用于出口食品中鸭源性成分的定性检测。此标准所
5、规定方法的最低检出限(LOD)为0.01%(W/W) 。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 鸭 Anatinae雁形目,鸭科,鸭亚科,鸭族,鸭属,常说的鸭是鸭亚科水禽的统称,也称真鸭。分为潜水鸭,钻水鸭和栖鸭。3.1.2 实时荧光 RAA real-time RAA
6、一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术(简称 RAA 技术) 。利用从细菌或真菌中获得的重组酶,在恒温下(一般为 3742 ) ,该重组酶可与引物紧密结合,形成酶和引物的聚合体,在单链 DNA 结合蛋白的帮助下,打开模板 DNA 的双链结构,当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹配的互补序列时,在 DNA 聚合酶的作用下,形成新的 DNA 互补链,扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记,随着 RAA 反应的进行,RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。3.1.3 Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。3.1.4 T 值 Time
7、threshold每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。以正式出版文本为准2SN/T 5227.420193.2缩略语下列缩略语适用于本文件。3.2.1RAA :recombinase-aid amplification,重组酶介导扩增。3.2.2DNA :deoxyribonuleic acid,脱氧核糖核酸。3.2.3CTAB :cetyltrithylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵。3.2.4Tris :tris(Hydroxymethyl)aminomethane,三羟甲基氨基甲烷。3.2.5EDTA :ethylene diaminetetraace
8、tic acid,乙二胺四乙酸。3.2.6dNTPs :deoxyribonuleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸。3.2.7SSB :single stranded DNA binding protein,单链 DNA 结合蛋白。3.2.8SC-recA :Streptomyces coelicolor recombinase,天蓝色链霉菌重组酶。3.2.9BS-recA :Bacillus subtilis recombinase,枯草芽孢杆菌重组酶。3.2.10Bsu :Bacillus subtilis,枯草芽孢杆菌。3.2.11Tricine :N-tris Hy
9、droxymethyl methylglycine,N- 三羟甲基甲基氨基酸。4 方法提要以提取的 DNA 为模板,采用鸭的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增,根据实时荧光RAA 的增幅情况,实现对食品和饲料中鸭成分的检测鉴定。5 试剂和材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。表 1 检测用引物和探针物种名称引物 / 探针序列(5 3)扩增片段长度靶基因鸭F :TCGCAGGAATCACCCTAGTCCACTTAACCTTC253bp线粒体细胞色素b 基因(Cytb)R :TATCATTCT
10、GGTTTAATGTGTGGTGGGGTTACP :TGTGACAAAATCCCATTCCACCCCTACTTCFAM-dTCTHFBHQ-dTTTAAGGACATCCTAGG-C3spacer 注:目的基因序列见附录 A。F 为上游引物,R 为下游引物,P 为探针,FAM-dT,THF,BQH-dT 和 C3spacer均为探针修饰基团。5.1 CTAB 提取缓冲液(pH8.0) :10 g/L CTAB,0.7 mol/L NaCl,0.05 mol/L Tris-HCl,0.01 mol/L Na2EDTA。5.2 酚 : 氯仿 : 异戊醇 =25 : 24 : 1。5.3 异丙醇。5.
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