EGCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡.pdf
《EGCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《EGCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、.4326ECCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡蔡月红,等EGCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡蔡月红,麦燕,钱沁佳三亚中心医院妇产科,海南三亚57 2 0 0 0【摘要】目的:探究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate,EG Cg)特异性抑制芳香乙酰胺脱乙酰基酶蛋白(arylacetamidedeacetylase,A A D A C)来诱导卵巢癌细胞发生铁死亡的分子机制。方法:体外培养卵巢癌细胞系(SK-OV-3、A 2 7 8 0、H e y 和SW626)。CCK-8 检测ECCg对卵巢癌细胞的半数抑制浓度(medi
2、an inhibition concentration,ICso)。铁离子检测试剂盒检测细胞内Fe2+的含量。活性氧(reactive ox-ygen species,ROS)检测试剂盒检测细胞内ROS 的含量。Westerm blot 检测细胞内铁死亡相关蛋白GPX4和NOX1的表达。酶活实验检测ECCg对AADAC活性的影响。Westernblot检测EGCg对AADAC蛋白的影响。应用免疫组化和Westernblot检测卵巢癌患者组织中AADAC的表达。应用siRNA沉默卵巢癌细胞总AADAC的表达。应用AADAC-KO敲除卵巢癌细胞中AADAC的表达。皮下成瘤验证小鼠体内EGCg对卵巢
3、癌移植瘤生长的影响。结果:ECCg能抑制卵巢癌细胞的增殖,且对SK-OV-3和SW626细胞较为敏感。ECCg使卵巢癌细胞中Fe2+含量增加,ROS含量增加,并抑制GPX4蛋白表达,促进NOX1蛋白的表达。ECCg能抑制AADAC蛋白的活性并促进其降解。AADAC在卵巢癌患者癌组织中高表达。沉默AADAC能促进卵巢癌细胞发生铁死亡。沉默AADAC后ECCg对卵巢癌细胞变得不敏感,并不能促进铁死亡的发生。相对于NC组,ECCg能抑制裸鼠移植瘤的生长,且移植瘤中AADAC表达下降,铁死亡被激活。结论:ECCg能特异性抑制AADAC来诱导卵巢癌细胞发生铁死亡。【关键词】EGCg;A A D A C;
4、卵巢癌;铁死亡;GPX4【中图分类号】R737.31【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.23.006【文章编号】16 7 2-4992-(2 0 2 3)2 3-432 6-0 8EGCg can induce ferroptosis in ovarian cancer cells byspecifically inhibiting AADACAI Yuehong,MAI Yan,QIAN QinjiaDepartment of Obstetrics and Gynecology,Sanya Central Hospital,Hainan San
5、ya 572000,China.【A b s t r a c t】1 Objective:To explore the molecular mechanism of epigallocatechin gallate(EGCg)specifically inhibi-ting arylacetamide deacetylase(AADAC)to induce ferroptosis in ovarian cancer cells.Methods:Ovarian cancer celllines(SK-0V-3,A2780,Hey and SW626)were cultured in vitro.
6、CCK-8 was used to detect median inhibitionconcentration(ICso)of EGCg in ovarian cancer cells.The iron ion detection kit detected the content of Fe2+ions incells.The reactive oxygen species(ROS)detection kits measured the amount of ROS in cells.The expressions of fer-roptosis related proteins GPX4 an
7、d NOXI were detected by Western blot.The effect of ECCg on AADAC activity wasdetected by enzyme activity test.The effect of EGCg on AADAC protein was detected by Western blot.Immunohisto-chemistry and Western blot were used to detect AADAC expression in ovarian cancer patients.siRNA was used to si-l
8、ence the expression of total AADAC in ovarian cancer cells.AADAC expression in ovarian cancer cells was knockeddown by AADAC-KO.The effect of EGCg on the growth of ovarian cancer transplantation tumor was verified by sub-cutaneous tumorigenesis.Results:EGCg could inhibit the proliferation of ovarian
9、 cancer cells and is sensitive to SK-OV-3 and SW626 cells.ECCg increased the content of Fe*and ROS in ovarian cancer cells,inhibited the expres-sion of GPX4 protein and promoted the expression of NOX1 protein.EGCg could inhibit the activity and degradation ofAADAC protein.AADAC was highly expressed
10、in ovarian cancer patients.Silencing AADAC promoted ferroptosis inovarian cancer cells.ECCg became insensitive to ovarian cancer cells after knockout of AADAC and did not promoteferroptosis.Compared with NC group,EGCg inhibited the growth of transplanted tumor in nude mice,and AADAC ex-pression was
11、decreased and ferroptosis was activated in transplanted tumor.Conclusion:EGCg could specifically in-hibit AADAC to induce ferroptosis in ovarian cancer cells.【收稿日期】2023-03-09【修回日期】2023-07-17【基金项目】海南省卫生计生行业科研计划项目(编号:18 A200164)【作者简介】蔡月红(198 5一),女,湖北潜江人,主治医师,主要从事妇科肿瘤的临床治疗工作。Ema i l:c a i y u e h o n g
12、 198 5 16 3.c o m?4327MODERNONCO.31.No.23现代肿瘤医学2023年12 月第31卷第2 3期Key words ECCg,AADAC,ovarian cancer,ferroptosis,GPX4在美国,2 0 2 3年卵巢癌居女性恶性肿瘤死亡率第五位。在女性生殖系统肿瘤中,卵巢癌的发病率排第三位。相较于宫颈癌和子宫内膜癌,卵巢癌由于早期症状不明显且不易排查,患者常发展到晚期才被诊断出来,且晚期卵巢癌患者的5年生存率只有2 0%30%2 。目前,手术治疗仍是卵巢癌的治疗核心,但仅针对早期卵巢癌患者有较好疗效。针对晚期和复发的卵巢癌患者的治疗,仍是一项艰巨的
13、挑战3。因此,针对卵巢癌新的治疗靶点和药物的研究显得极其重要。天然多酚是一种常见的食品成分,可从绿茶等植物中提取。在过去几十年的科学研究中,绿茶和它特有的多酚,已经被证明在预防肥胖、糖尿病、心血管疾病、癌症和其他疾病中起到重大作用4。绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯(e p i g a l l o c a t e c h i n g a l l a t e,EG Cg)是一种天然的抗肿瘤药物。ECCg的抗癌活性已在不同动物模型和细胞系中得到证实4。现研究表明,ECCg是一种氧化还原活性分子,其可以通过自身的自氧化产生活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)和过氧化氢,进而引
14、起细胞发生氧化应激5。在抗肿瘤研究中,较高水平的ROS可引起肿瘤细胞的损伤,最终导致细胞死亡。尽管现在关于EGCg的研究很多,但EGCg发挥功能的靶点还是未知的。YASUDA教授6 于2 0 2 1年发现,EGCg能够有效抑制芳香乙酰胺脱乙酰基酶蛋白(arylacetamidedeacetylase,A A D A C)的酶活性。这提示我们,AADAC可能是EGCg发挥抗肿瘤作用的关键靶点。AADAC是一种芳基乙酰胺去乙酰化酶,主要在肝脏中表达,与药物代谢有关7 有研究表明,AADAC基因突变的患者有较低的药物清除率8 。在2 型糖尿病的研究中发现,将血管平滑肌细胞中的AADAC敲除后,细胞中
15、脂质含量明显增加。在结肠癌的肝转移研究中,AADAC通过SLC7A11依赖性抑制脂质过氧化保护结直肠癌肝脏定植免于铁死亡9目前学术界普遍认为卵巢癌起源于卵巢伞部的干细胞10-1。在卵巢癌原始细胞遗传模型中发现,卵巢恶性肿瘤中转铁蛋白受体1(transferrinreceptor1,TFR1)的表达呈明显上调,而铁转运蛋白(ferroportin,FPN)的含量则明显降低,表明卵巢肿瘤早期阶段出现细胞内铁含量的升高。综上,EGCg能增加细胞内ROS的产生,引起细胞脂质过氧化。而AADAC作为一种脂质代谢相关基因,能抑制脂质过氧化从而抑制癌细胞发生铁死亡。因此,我们大胆推测EGCg可能通过抑制AA
16、DAC来促进卵巢癌细胞发生脂质过氧化,从而促进肿瘤细胞的铁死亡1资料与方法1.1标本收集收集2 0 2 0 年0 1月至2 0 2 1年0 6 月在我院手术治疗的78例卵巢癌患者的石蜡标本,患者平均年龄为(45.2 17.7)岁。同时,我们收集了3例卵巢癌患者的临床活体标本,每例分成若干份,冻存在8 0 冰箱中。本研究经医院伦理委员会批准,并获得所有患者的书面知情同意书。1.2实验方法1.2.1细胞培养卵巢癌细胞株SK-OV-3、A 2 7 8 0、H e y 和SW626均购Modern Oncology 2023,31(23):4326-4333自于ATCC(美国模式菌种收集中心)。所有细
17、胞均用含10%胎牛血清(BI,Israel)、10 g/mL链霉素和10 0 U/mL青霉素(BI,Israel)的DMEM(G i b c o,M D,U SA)培养基,置于37、5%CO 2 的培养箱中培养。1.2.2细胞转染细胞于对数生长期时,用0.2 5%的胰蛋白酶消化细胞,将细胞按照每孔310 5个接种在6 孔板中。常规培养18 h后(细胞密度约为7 0%),按照Lipofectamine2000(In v i t r o g e n,USA)说明书进行转染,转染分组为:si-NC(转染 si-NC的阴性对照序列)、si一AADAC(转染siA A D A C的敲低序列)。siRNA
18、的合成由上海GenePharma公司完成。所用siRNA序列见表1。细胞转染2 4h后,收获细胞提取蛋白或者消化细胞铺板进行下一步实验。表1siRNA序列Tab.1siRNA sequenceGene namePrimer sequencesi-AADAC#15-AAUAUAAUAUGCUAUGAGGAU-3*si-AADAC#25-AAUUUUGUAUAGUUUUCAGAU-3*1.2.3慢病毒感染通过 https:/zlab.bio/guide-design-resources/网站设计出2 条AADAC基因的敲除序列,分别为:KO1(T G A A T T GGGAAATGATACTT)
19、和KO2(GGGCAGGATAAATTAAAGAC)。然后由上海GenePharma公司将序列构建到lentivirus crisprcas9V2质粒上并包装成慢病毒,慢病毒滴度为10 TU/mL。将慢病毒感染SK-OV-3和SW626细胞,通过嘌呤霉素(上海生工生物)筛选,铺单克隆,扩增,得到AADAC基因敲除的单克隆细胞株。后续将用该细胞进行一系列细胞和分子实验。1.2.4药物实验将EGCg(Sellcek,USA)配置成10 mmol/L的母液浓度,通过浓度梯度:40、2 0、10、5、2、1umoVL,筛选出SK-0V-3和SW626细胞的半数抑制浓度(median inhibitio
20、n concentration,ICso)。得到对应细胞的ICso后,进行一系列的细胞和分子实验。1.2.5AADAC原核表达和纯化将AADAC的全长序列构建到pet28a质粒(His标签)上,经过BL21细菌的扩增和表达,Ni柱的回收和纯化后,得到AADAC蛋白。上述实验,均由北京义翘神州公司完成。1.2.6酶活实验根据YASUDA教授论文中描述的方法6 ,我们研究了EGCg对原核表达的AADAC蛋白酶活性的影响。具体方法如下:非那西汀作为AADAC的特异性底物。测定的底物浓度分别根据非那西汀在AADAC蛋白中的水解酶活性的Km值进行测定。为测定非那西汀水解酶活性,将含有100mmol/L磷
21、酸盐缓冲液(pH7.4)、0.4m g/m LA A D A C和1mmol/L非那西汀的反应混合物在37 下孵育2 0 min。加人3%的高氯酸后,反应停止。然后通过高效液相色谱检测非那西汀的产物对氨基苯乙醚的含量,以此推算出AADAC的酶活性。:43 2 8.ECCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡蔡月红,等1.2.7逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)使用Trizol试剂(15596 0 2 6,Invitrogen,U SA)提取总的RNA,按照 PrimeScript RT reagent Kit(RR047A,Takara,Japan)说明书,取5gRNA反转录
22、cDNA,对合成的10 ngcDNA用Fast SYBR Green PCR试剂盒(Applied biosystems)进行RT-qPCR检测,每个孔均设置3个重复。-actin作为内参,采用2-AACT法分析AADAC、NO X1基因相对表达量,CT=(实验组目的基因平均CT值-实验组管家基因平均CT值)-(对照组目的基因平均CT值对照组管家基因平均CT值)。引物设计如表2 所示。表2引物序列Tab.2Primer sequenceGene namePrimer sequenceAADACF5-ATCGCTGTACCTTCTGATTGTG-3*R5-CAAAGCTCCCGACAACCTTA
23、AA-3*NOX1F5-TTGTTTGGTTAGGGCTGAATGT-3*R5-GCCAATGTTGACCCAAGGATTTT-3*CPX4F5-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTA-3R5-CCGAACTGGTTACACGGGAA-3-actinF5-CTTAATGTCACGCACGATTTC-3*R5-ACGTTATGGTGATGATATCG-31.2.8蛋白质印迹(Westernblot)胰蛋白酶消化法收集培养的各组细胞,用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(武汉博士德公司)进行裂解,然后用BCA蛋白定量试剂盒(武汉博士德公司)进行蛋白浓度的测定。蛋白用10%SDS-PAGE进行分
24、离,将分离后的蛋白质电转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2 h以阻断非特异性结合,分别加人稀释的一抗(AADAC:a b 2 2 412 7;NO X1:ab131088;GPX4:ab125066;GAPDH:ab8245;Abcam,Cam-bridge,U K),4孵育过夜,洗膜加人HRP标记的羊抗兔二抗(ab205719;A b c a m,Ca mb r i d g e,U K)室温孵育1h,洗膜后加人ECL工作液(美国EMDMillipore公司),在化学发光仪中进行曝光。用ImageJ分析软件对Westernblot图像中各组条带进行灰度定量,GAPDH作为内参。每次实验重
25、复3次。1.2.9细胞增殖实验将110 个/mL细胞接种到96 孔板中,每孔10 0 L常规培养过夜。按照CCK-8试剂盒(上海Beyotime)说明书处理细胞,分别在接种后的第2 4、48、7 2、96 h,以CCK-8法检测其细胞活力。每次检测时均加入10 L的CCK-8检测液,放入培养箱中孵育4h,用酶标仪(ThermoScientificMulti-skanFC)检测其在450 nm处的吸光度,绘制生长曲线。每次实验重复3次。1.2.10细胞内铁离子检测细胞中铁离子检测试剂采用北京范德生物的FerroOrangeFe2+检测探针。按照说明书,具体操作如下:在96 孔黑板(透明底)上接种
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- EGCg 通过 特异性 抑制 AADAC 诱导 卵巢癌 细胞 生铁 死亡
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。