IGF-1过表达的骨髓间充质干细胞保护软骨细胞免受IL-1β诱导的损伤.pdf
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1、基金项目:新疆维吾尔自治区重点研发计划项目(2 0 2 1 B 0 3 0 0 6);新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2 0 2 2 D 0 1 C 1 7 0)作者简介:向文远(1 9 8 9-),男,副主任医师,博士,研究方向:骨与关节损伤。通信作者:方 锐,男,主任医师,教授,博士,研究方向:骨与关节损伤,E-m a i l:6 0 1 3 0 9 0 9 6q q.c o m。本文引用:向文远,易 林,邓迎杰,等.I G F-1过表达的骨髓间充质干细胞保护软骨细胞免受I L-1诱导的损伤J.新疆医科大学学报,2 0 2 3,4 6(9):1 1 3 2-1 1 3 7,1 1 4 4
2、.d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-5 5 5 1.2 0 2 3.0 9.0 0 3I G F-1过表达的骨髓间充质干细胞保护软骨细胞免受I L-1诱导的损伤向文远1,2,易 林1,邓迎杰2,方 锐2(1新疆医科大学第四临床医学院,乌鲁木齐 8 3 0 0 5 4;2新疆医科大学附属中医医院骨二科,乌鲁木齐 8 3 0 0 9 9)摘要:目的 探讨胰岛素样生长因子-1(I G F-1)过表达的骨髓间充质干细胞(BM S C s)对白细胞介素1(I L-1)诱导的软骨细胞损伤的影响及相关机制。方法 慢病毒转染构建I G F-1过表达的BM S C s,使用
3、倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原表达,实时定量P C R和W e s t e r n b l o t法检测I G F-1 mR NA及蛋白表达情况。将I G F-1慢病毒转染的BM-S C s、空载体慢病毒转染的BM S C s、BM S C s分别与5 n g/m L I L-1诱导的大鼠软骨细胞共同培养2 4 h后,C C K-8检测软骨增殖情况;T u n e l法检测软骨细胞凋亡率;W e s t e r n b l o t法检测B c l-2相关X蛋白(B a x)、B淋巴细胞瘤-2(B c l-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(C a s p a s
4、e-3)、细胞色素C(C y t c)蛋白表达;酶联免疫吸附试验(E L I S A)检测细胞提取液中I L-1、白细胞介素6(I L-6)和肿瘤坏死因子-(T N F-)水平。结果 I G F-1过表达的BM S C s提高I L-1处理的软骨细胞增殖活性,抑制I L-1诱导的软骨细胞凋亡,并降低细胞提取液中I L-1、I L-6和T N F-水平(P0.0 5),下调软骨细胞中B a x、C a s p a s e-3、C y t c等凋亡蛋白的表达水平,上调抗凋亡蛋白B c l-2的表达水平(P0.0 5)。结论 I G F-1过表达的骨髓间充质干细胞可抑制I L-1诱导的软骨细胞凋亡及
5、炎性因子的表达,提高软骨细胞增殖活性。关键词:慢病毒;I G F-1基因;骨髓间充质干细胞;软骨细胞中图分类号:R 3 6 4.5;R 6 8 4.3 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 9-5 5 5 1(2 0 2 3)0 9-1 1 3 2-0 7d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-5 5 5 1.2 0 2 3.0 9.0 0 3I G F-1 o v e r e x p r e s s e d b o n e m a r r o w m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s p r o t e c t c h
6、 o n d r o c y t e s f r o m I L-1-i n d u c e d i n j u r y X I A N G W e n y u a n1,2,Y I L i n1,D E N G Y i n g j i e2,F A N G R u i2(1F o u r t h C l i n i c a l M e d i c a l C o l l e g e o f X i n j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 5 4;2D e p a r t m e n t o f O r
7、 t h o p e d i c s,t h e A f f i l i a t e d T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e H o s p i t a l o f X i n j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 9 9,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e E x p l o r i n g t h e e f f e c t s o f I G F-1 o v e r e x p r
8、 e s s i o n o n I L-1 i n b o n e m a r r o w m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s(BM S C s)t h e e f f e c t s a n d r e l a t e d m e c h a n i s m s o f i n d u c e d c h o n d r o c y t e d a m a g e.M e t h o d s O v e r-e x p r e s s i o n BM S C s o f I G F-1 w a s c o n s t r u c t e d b
9、 y t r a n s f e c t i o n o f l e n t i v i r u s.T h e c e l l m o r p h o l o g y w a s o b-s e r v e d b y i n v e r t e d m i c r o s c o p e,t h e s u r f a c e a n t i g e n e x p r e s s i o n o f b o n e m a r r o w m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s w a s i d e n t i f i e d b y f l o
10、 w c y t o m e t r y,t h e mR NA a n d p r o t e i n e x p r e s s i o n o f I G F-1 g e n e w a s d e t e c t e d b y r e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R a n d W e s t e r n b l o t,a n d t h e BM S C s a n d BM S C s t r a n s f e c t e d w i t h e m p t y b o d y l e n t i v i r u s w e
11、 r e c o m p a r e d w i t h 5 n g/m L I L-1 i n d u c e d r a t c h o n d r o c y t e s w e r e c o-c u l t u r e d f o r 2 4 h o u r s.C C K-8 w a s u s e d t o d e t e c t c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n,T u n e l m e t h o d w a s u s e d t o d e t e c t c h o n d r o c y t e a p
12、 o p t o s i s r a t e.第4 6卷 第9期新 疆 医 科 大 学 学 报V o l.4 6 N o.9 2 0 2 3年9月J o u r n a l o f X i n j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t yS e p.2 0 2 3 W e s t e r n b l o t w a s u s e d t o d e t e c t p r o t e i n e x p r e s s i o n o f B a x,B c l-2,C a s p a s e-3,a n d C y t c,a n d E L I
13、S A w a s u s e d t o d e t e c t t h e l e v e l o f I L-1,I L-6 a n d T N F-.R e s u l t s BM S C s o v e r e x p r e s s i n g I G F-1 w a s i n c r e a s e d t h e p r o l i f e r a t i o n a c t i v i t y o f c h o n d r o c y t e s t r e a t e d w i t h I L-1,i n h i b i t e d t h e a p o p t
14、o s i s o f c h o n d r o c y t e s i n-d u c e d b y I L-1,a n d i t w a s d e c r e a s e d t h e l e v e l s o f I L-1,I L-6 a n d T N F-i n t h e c e l l e x t r a c t(P0.0 5),d o w n-r e g u l a t e d t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f a p o p t o s i s p r o t e i n s s u c h a s B a x,
15、C a s p a s e-3 a n d C y t c,a n d u p-r e g u l a-t e d t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f a n t i-a p o p t o s i s p r o t e i n B c l-2(P0.0 5).C o n c l u s i o n T h e a p o p t o s i s o f c h o n d r o-c y t e s a n d t h e e x p r e s s i o n o f i n f l a mm a t o r y f a c t o r s i
16、 n d u c e d b y I L-1 i n b o n e m a r r o w m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s m a y p l a y a r o l e i n i m p r o v i n g t h e p r o l i f e r a t i o n o f c h o n d r o c y t e s b y r e g u l a t i n g I G F-1.K e y w o r d s:l e n t i v i r u s;I G F-1 g e n e;b o n e m a r r o w m e
17、 s e n c h y m a l s t e m c e l l s;c h o n d r o c y t e s 骨关节炎(O s t e o a r t h r i t i s,OA)是临床最常见的骨关节退行性疾病,以关节软骨破坏、变性以及骨质增生为主要表现,其中关节软骨缺乏血液供应且易受损,一旦损伤就难以自身修复1。因此,关节软骨修复是国内外研究的热点2。骨髓间充质干细胞(B o n e m a r r o w m e s e n c h y-m a l s t e m c e l l s,BM S C s)作为目前组织工程学中最具潜力的种子细胞3,具有良好组织分化及免疫调节能力,
18、可以调节软骨受损部位局部微环境,抑制软骨细胞凋亡、变性,进而促进组织修复4-5。胰岛素样生长因子-1(I G F-1)是软骨自稳态调节以及其发育中重要的生长因子之一,它能促进软骨细胞增殖分裂6。同时,I G F-1是BM S C的重要旁分泌生长因子7,有研究表明,骨髓间充质干细胞中I G F-1的过度表达导致脊髓损伤中细胞存活、免疫调节和功能改善的增加8。研究显示,外源基因经慢病毒介导后易于导入间充质干细胞,并获得高效、长期表达9。因此,本研究采用I G F-1慢 病毒载体转 染BM S C s抑制体外白细胞介素-1(I L-1)诱导条件下软骨细胞的凋亡,提高软骨细胞增殖活性,探讨其中可能的机
19、制。1 材料与方法1.1 细胞和试剂 大鼠骨髓间充质干细胞(货号:C P-R 1 3 1)、软骨细胞(货号:C P-R 0 8 7)购于武汉普诺赛生命科技有限公司;1 0%胎牛血清完全培养基(P r o c e l l公司);0.2 5%胰蛋白酶溶液(武汉普诺赛生命科技有限公司);P E(美国I n v i t r o g e n公司);5 n g/m L I L-1(美国R D公司);实时荧光定量P C R仪(美 国I n v i t r o g e n公 司);C C K-8试 剂 盒(美 国MC E公司);L e n t i-I G F-1-E G F P慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限
20、公司),I G F-1、B淋巴细胞瘤-2(B c l-2)、B c l-2相关X蛋白(B a x)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(C a s p a s e-3)、细胞 色素C(C y t c)抗 体(A f f i n i t y公司);A n n e x i n V-A P C/7-AA D细胞凋亡检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司);倒置显微镜(日本O L YMP U S公司)。1.2 BM S C s培养鉴定和转染 将原代大鼠B M S C s复苏后接种于2 5 c m2细胞培养皿中,加入3 m L含9 0%-MEM+1 0%胎牛血清,置于5%C O2,3 7培养箱中培养。观察并记
21、录细胞形态和生长情况,生长至8 5%融合时进行传代培养。使用流式抗体染色收集的BM S C s,并经流式细胞仪检测其表面抗原C D 9 0、C D 3 4的表达,以鉴定BM S C s。取P 3代BM S C s接种6孔板,细胞密度生长至6 0%,加入不同转染复数(M u l t i p l i c i t y o f i n f e c t i o n,MO I)的慢病毒,包括包装好的L e n t i-I G F-1-E G F P慢病毒、空白L e n t i-E G F P慢病毒,混匀培养并更换新鲜的1 0%胎牛血清的培养基,继续培养,7 2 h后在荧光显微镜下观察结果。当MO I=4
22、 0时,细胞转染效率达到9 7%,设为最佳感染复数值。取最佳转染复数值的慢病毒转染BM S C s,接种于6孔板,孵育2 4 h后,分为U C-BM S C s组、U C-BM S C s-v e c t o r组和U C-BM S C s-I G F-1组,细胞计数后按照31 05个/m L接种于1 2孔培养板中,实时定量P C R检测细胞中I G F-1基因的表达。在9 52 m i n,9 55 s,6 21 5 s,3 9个循环,使用R e a l-t i m e P C R仪进行检测。引物序列详见表1。表1 荧光定量P C R检测引物序列引物序列(5 -3)长度/b pGA P DH
23、 正向A C A G C AA C A G G G T G G T G GA C2 5 3 反向T T T GAG G G T G C A G C GAA C T TI G F-1 正向G C T C T T C A G T T C G T G T G T G G2 1 5 反向G T C T T G G G C AT G T C A G T G T G1.3 软骨细胞的培养 使用含1 0%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞,接种到2 5 c m2细胞培养皿中,轻轻吹打混匀,3 7、5%C O2饱和湿度条件下培养。1.4 软骨细胞共培养分组处理 取大鼠软骨细胞调整细胞浓度为11 04/孔,接种于t
24、r a n s w e l l 2 4孔板的外室中,分为 正常对照组、I L-1组、I L-1+3311 第9期 向文远,等:I G F-1过表达的骨髓间充质干细胞保护软骨细胞免受I L-1诱导的损伤BM S C s组、I L-1+BM S C s-v e c t o r组、I L-1+I G F-1-BM S C s组。正常对照组常规培养,其余组使用5 n g/m L I L-1干预软骨细胞,分别加入I G F-1慢病毒转染的BM S C s、空载慢病毒转染BM S C s、未转染的BM S C s,于体积分数1 0%胎牛血清的DMEM培养基,3 7、5%C O2培养箱培养2 4 h。1.5
25、 C C K-8检测细胞增殖 在干预2 4 h后,去除外室原有培养基,每孔加入5 0 0 L新鲜培养基与5 0 L C C K-8,3 7培养2 h后,酶 标仪测定每 孔4 5 0 n m处的吸光度值(O D),计算细胞增殖水平。1.6 T u n e l法检测软骨细胞凋亡 软骨细胞接种至载玻 片,4%多 聚 甲 醛 室 温 固 定。爬 片 上 滴 加2 0 g/m L的P r o t e i n a s e K溶液。去离子水溶液润洗爬片,去 掉 多 余 液 体。爬 片 滴 加E q u i l i b r a t i o n B u f f e r,室温孵育1 5 m i n。冰上解冻B r
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