FACS技术在酶定向进化中的应用.pdf
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1、技术与方法生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(10):93-106收稿日期:20230523基金项目:国家重点研发专项(2019YFA0904104),国家自然科学基金项目(22278033)作者简介:刘金升,硕士研究生,研究方向:生物传感器的高通量筛选;Email: 通讯作者:陈振娅,博士,副研究员,研究方向:生物传感器和蛋白质工程;Email:;郭淑元,博士,教授,研究方向:基因编辑和蛋白质工程;Email:流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种广泛应用于生物学、医学和药物研发等领域的重要技术。FCM可以快速、高通量地分析溶液中的单个细
2、胞,并且能同时获取多个参数信息,例如细胞大小、形态、表面标记、代谢状态、DNA 含量等。这些信息对于了解细胞的生物学特性、疾病发生机制、药物筛选FACS 技术在酶定向进化中的应用刘金升 陈振娅 霍毅欣 郭淑元(北京理工大学生命学院,北京 100081)摘 要:流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种在单细胞水平上对大量细胞进行快速、相对定量的多参数分析技术。基于 FCM 建立的荧光激活细胞分选术(fluorescenceactivated cell sorting,FACS)可物理分离荧光标记的单细胞,目前已被广泛应用于酶定向进化领域。定向进化已被证明是获得高酶活、强热稳定性、
3、耐溶剂性等优良性质工业酶的有效方法,其首先需通过随机突变和 DNA 重组等方法构建酶突变文库,随后需在人工选择压力下对突变文库进行筛选。传统筛选方法如平板法、微孔板法等,存在通量低、成本高、误差大、准确性差等局限,无法实现对大型文库的高通量筛选。相较于传统筛选方法,FACS 具有高通量、耗费低、误差小、精度高等优势。本文首先总结了 FCM 及 FACS 的发展进程,以及由此衍生的相关仪器的组成和分类,随后讨论了 FACS 在酶定向进化中的应用现状及现阶段的应用局限性,最后总结并展望了 FACS 发展方向及其在酶定向进化领域的应用前景。关键词:流式细胞术;荧光激活细胞分选;高通量筛选;定向进化D
4、OI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.20230486Application of FACS Technology in the Directed Evolution of EnzymeLIU Jinsheng CHEN Zhenya HUO Yixin GUO Shuyuan(School of Life Science,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081)Abstract:Flow cytometry(FCM)is a rapid and relatively quantitative multipara
5、meter analytical technique for analyzing a large number of cells at the singlecell level.The constructed fluorescence activated cell sorting(FACS)based on FCM can physically separate fluorescentlabeled single cells and has been widely used in the field of directed evolution of enzyme.Directed evolut
6、ion has been proven to be an effective method for obtaining industrial enzymes with excellent properties,such as high enzyme activity,strong thermal stability and solvent resistance.To conduct directed evolution,mutant library firstly needs to be constructed by random mutagenesis or DNA recombinatio
7、n,and then be screened under manual selection pressure.Traditional screening methods such as plate and microplate methods have limitations of low throughput,high cost,large errors,and poor accuracy,and cannot achieve highthroughput screening of large mutant library.Compared with traditional screenin
8、g methods,FACS has the advantages of high throughput,low cost,small error and high precision.In this article,we first summarized the development process of FCM and FACS,as well as the composition and classification of related instruments derived from them.Then,we discussed the application status and
9、 limitations of FACS in the directed evolution of enzyme.Finally,we summarized and prospected the development direction of FACS and its application in the field of directed evolution of enzyme.Keywords:flow cytometry;fluorescenceactivated cell sorting;highthroughput screening;directed evolution生物技术通
10、报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.1094和疗效评估等都具有重要的意义。目前,FCM 与质谱、显微成像等技术结合,形成了多种功能的组合技术,已广泛应用于免疫学、分子生物学、细菌学、病毒学、癌症生物学和传染病监测等领域1-7。其中,荧光激活细胞分选术(fluorescenceactivated cell sorting,FACS)是基于 FCM 建立的一种可以实现荧光标记单细胞分选的技术8。由于温度、pH 和溶剂稳定性,以及底物特异性和活性的限制,天然酶通常不是工业生产的最佳选择。定向进化是改善酶催化活性和热稳定性的常用方法9-10,利用易错 PCR
11、等技术10-12能够大量增加目标酶基因的多样性,例如,对一个酶的 5 个氨基酸进行饱和突变,其理论突变文库大小能达到205,那么如何从此大型文库中获得目标单一突变体是关键问题。如果利用传统微孔板筛选13,需耗费大量的成本和时间,因此高通量筛选方法在酶定向进化中显得尤为重要。近几年来,具有高通量、耗费低、误差小、精度高等优势的 FACS,已经广泛应用于大型突变文库的筛选,其筛选通量从传统筛选方法的 1/s 提高到104/s8,并且在筛选流程中的培养基消耗量相较于传统筛选可以忽略不计。利用传统微孔板筛选约 105大小的突变库,至少需要 104 mL 培养基,而 FACS仅需数毫升。同时,FACS
12、可以减少培养过程中人工干预所带来的误差,并且相较于传统酶标仪检测具有更高的荧光检测精度。由此,本文首先概述了FCM 的发展历程和原理,并简述了基于 FACS 技术建立的流式细胞分选仪。随后,详细讨论了 FACS在酶定向进化中的应用现状及局限,并展望了 FACS在该领域中的发展方向和前景。1 FCM 和 FACS1.1 FCM的发展及应用FCM 是一种用于分析、计数、分类单个细胞的技术,具有高分辨率、高通量和多参数分析等优点,广泛应用于生命科学领域,例如免疫学、细胞学、肿瘤学、生殖学、遗传学、神经科学等。其发展历史可以追溯到 20 世纪 50 年代,主要经历了 3 个阶段。早期流式细胞术:FCM
13、 主要被用于血细胞计数。1969 年,Leonard Herzenberg 和他的团队成功地使用基于 FCM 搭建的流式细胞仪对免疫细胞进行分析,主要使用光散射和荧光染色等技术来对细胞进行分类和计数,证明了 FCM 在免疫学研究中的潜力14。多参数流式细胞术:在 20 世纪 80 年代和 90 年代,随着荧光染料和光学检测技术的发展,FCM 实现了多参数分析15。现代流式细胞术:随着 20 世纪末期和 21 世纪初期生物技术的迅速发展,FCM 开始往单细胞基因表达分析16、细胞分选17和多模态成像18等方向发展,并衍生出光谱流式细胞术18、成像流式细胞术19和质谱流式细胞术20等技术。FCM
14、在全血细胞计数21、循环肿瘤细胞检 测22、荧光原位杂交23、抗原检测24和细胞增殖 和凋亡测定25等领域有着广泛的应用26-27。目前,基于 FCM 开发了各种市场化的流式细胞仪,主要分为有声聚焦流式细胞仪、细胞分选仪、成像流式细胞仪、质谱流式细胞仪、全光谱流式细胞分析仪、基 于微珠矩阵分析细胞仪和纳米流式细胞仪等27-33。1.2 FACS的原理及相关仪器1.2.1 FACS 的原理 FACS 的基本原理是单个细胞依次通过一个细管,并对携带荧光信号的细胞进行定量检测、数据分析和细胞分选8。主要流程包括:(1)样品制备,制备单细胞悬液;(2)标记细胞,利用荧光染料标记单细胞;(3)信号检测,
15、通过流式细胞仪获取前向散射光(forward scatter,FSC)、侧向散射光(side scatter,SSC)和荧光信号等数据;(4)分析和数据处理,电子器件对检测到的信号进行处理,将其转换成数字信号,计算机软件对数字信号进行分析和处理,例如数据统计、细胞计数、细胞排序和可视化显示等;(5)细胞分选,对细胞群体进行数据分析后,可依据荧光信号强度或细胞大小等选择性地对包裹单细胞的液滴进行加电,并通过电场力的作用收集单细胞到指定容器中。1.2.2 荧光信号 FACS 依赖于荧光信号,荧光是一种光致发光的现象,即某种物质经入射激光(激发光)照射后,吸收光能并瞬间进入激发态,随后立即退出激发态
16、并发射出比激发光波长长的发射光,该发射光的波段通常为可见光。计算机软件将检测到的荧光信号数字化,这些数据用于分析细胞的荧光特性,例如荧光强度的分布、荧光峰值的位置和形状等。2023,39(10)95刘金升等:FACS 技术在酶定向进化中的应用通常,可采用如下方法使细胞携带荧光信号:荧光染料染色、表达荧光蛋白和添加荧光标记底物。常用荧光染料包括小分子有机染料34、量子 点35-36、藻胆蛋白37和荧光示踪染料(核酸染料、细胞质染料和膜结合染料)17等。细胞表达的不外泌荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)
17、及其各种衍生物,如eGFP、Superfolder GFP、eCFP 和 eYFP 等38。添加可溶性荧光标记底物的方法主要包括:首先将底物进行荧光标记,随后通过液滴微流控芯片将荧光标记底物和细胞一起封装在均匀分散的液滴内,每个液滴的体积及其内部的荧光标记底物浓度均是相同的。细胞表达的酶可将荧光标记底物转化为荧光产物来作为细胞的荧光信号39-40。1.2.3 流式细胞分选仪 流式细胞分选仪是一种基于 FACS 技术而设计的单细胞分析和分选设备,其已广泛应用于生物学、医学和生物技术领域。该设备能够快速地分析细胞或颗粒的多个参数,包括大小、复杂度、表面标记和荧光信号等,以获取大量的细胞特征信息。流
18、式细胞分选仪的工作原理是利用细胞或颗粒在鞘液中流动时,通过检测激光照射后发射出的荧光信号和散射光信号来识别和分析细胞或颗粒的特征,通过计算机控制选择性地收集具备一定特征的目标细胞。流式细胞分选仪的基本组成部分包括液流系统(产生单液滴)、光学系统(信号检测)、电子控制系统(分选细胞)和计算机系统(分析信号数据)等。2 酶定向进化天然酶具有丰富的结构和生化特性,但由于其催化性能的局限性,导致仅有少部分天然酶能直接用于工业生产40-41。为了提高天然酶的催化性能,扩大其工业生产范围,定向进化方法应运而生,利用此方法可以改善酶的耐受性、特异性和稳定性等42,以适应工业生产。定向进化主要有 3 个步骤:
19、(1)构建突变文库。通过随机突变、定点突变、饱和突变和 DNA 重组等技术手段10-12对目标酶基因造成大量突变,以此构建目标酶基因的突变文库;(2)筛选突变文库。利用特定的筛选方法对具有一定表型的突变体进行高通量筛选,例如荧光信号、吸光度等;(3)迭代。将回收的优势突变体再次构建突变文库,并筛选突变文库,这种循环迭代的方法能够提高酶定向进化的效率。目前,主要用于酶定向进化的筛选方法有平 板 或 微 孔 板、FACS8和 荧 光 激 活 液 滴 分 选(fluorescenceactivated droplet sorting,FADS)43等技术。相较于平板或微孔板筛选,FACS 和 FAD
20、S 不仅具有通量更高的优点,同时具有培养体系简便、培养基使用量少、选择压力均衡等优势。例如,在构建文库后可直接混合宿主细胞进行培养,无需建立单个突变体的单反应培养体系,而且每个突变体受到的选择压力是完全相同的,极大减少了人工干预造成的误差。FACS 和 FADS 在鞘液、分选方式和假阳性方面存在一些差异。FACS 是使用经 0.22 m滤膜过滤后的 PBS 或蒸馏水作为鞘液,无法使用腐蚀性或黏稠性液体作为鞘液,而 FADS 通常使用黏性较大的油作为鞘液。FACS 主要通过对包含细胞的液滴加电,随后在电场力的作用下将细胞收集到指定容器中来实现细胞分选,而 FADS 则是在液滴流动通道的一侧利用介
21、电泳力来实现细胞分选。当将荧光产物固定在细胞表面时,由于 FACS 分选前细胞是混合培养的,存在荧光产物可能会转移到其他细胞表面的风险,容易产生假阳性结果,而 FADS采用液滴间隔单细胞培养的方法,极大地降低了假阳性的风险。本文总结了定向进化中的传统筛选(平板、微孔板)、FACS 和 FADS 筛选方法的通量、突变文库大小、优缺点等信息,如表 1 所示。FACS 应用于酶定向进化的主要流程如图 1 所示8,52。首先,需构建含有目标酶基因的质粒突变文库,并通过荧光标记底物、生物传感器偶联酶自产荧光蛋白等建立荧光表型,然后将质粒文库转化进宿主细胞中,如大肠杆菌(Escherichia coli)
22、、酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)、杆状病毒、哺乳动物细胞等;随后,培养宿主细胞以产生荧光信号表型;最后,利用 FACS 对有荧光信号表型的宿主细胞进行高通量筛选,基于荧光强度的高低分选目标宿主细胞,对分选得到的目标宿主细胞进行富集培养,测序验证目标酶的突变位点,同时可进行重复分选或定向进化。本文以大肠杆菌自产 GFP 荧光蛋生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.1096白为例,说明 FACS 在酶定向进化中的应用原理(图1),详细荧光信号表型在下文中概述。细胞表达酶后,酶的位置可以分布在细胞表面、细胞内和细胞外,分
23、别形成细胞表面酶、胞内酶和分泌酶,如何将不同位置酶的活性与荧光信号偶联是 FACS 进行高通量筛选的关键问题,同时为提高单细胞荧光信号检测的准确性,需保证突变文库中不同细胞的荧光信号互不干扰。本文将从细胞表面酶、胞内酶、分泌酶与荧光信号的偶联关系出发,阐述了 FACS 高通量筛选的设计原则,并列举相关应用实例。3 FACS 在非分泌酶定向进化中的应用在非分泌酶(细胞表面酶和胞内酶)的定向进化筛选中,基于酶的存在位置和荧光信号来源,可以将其筛选分为 3 种方式:第 1 种是荧光标记底物(如荧光素、BODIPY、香豆素等荧光基团53)筛选细胞表面酶,此方法的目标酶通常暴露于细胞表面,其催化底物后产
24、生的荧光产物会通过静电力作用、共价或非共价键的方式保留在细胞表面;第 2 种是荧光标记底物筛选胞内酶,此方法的目标酶存在于细胞内,其荧光产物不能扩散出细胞;第 3 种是生物传感器筛选胞内酶,此方法通过使用对底物或产物有响应的生物传感器,并由此驱动荧光蛋白表达,表 1 筛选方法比较Table 1 Comparison of screening methods筛选方法Screening method通量Throughput突变文库Mutant library特点Characteristic参考文献References平板105-106操作简便;半定量分析;通量低;精度低44-47微孔板1/s105
25、操作简便;定量分析;通量低;精度低13,47FACS104/s108通量高;消耗少;精度高;单细胞定量分析;设备昂贵;不便携8,48FADS107)进行了筛选,使用两种荧光基团(绿色荧光基团和蓝色荧光基团)来标记底物(GalNAc 类似物),分别获得绿色荧光标记底物和蓝色荧光标记底物,这两种底物可以自由穿过细胞膜。这两种荧光标记底物进入细胞后,会被胞内 CgtB 催化产生的相应产物,这些产物无法进出细胞,通过检测细胞的绿色荧光和蓝色荧光来判断 CgtB 的催化活性高低,从而进行后续的检测和筛选。最终,通过 FACS 筛选获得了比天然 CgtB 活性提高了 300 倍的突变体。Kovaevi 等
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