LncRNA SNHG16靶向调控miR-516a-5p对结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响.pdf
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1、实用医学杂志 2023年第39卷第20期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.20LncRNA SNHG16靶向调控miR-516a-5p对结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响杨丰帅 邱东达 杨运泉 龚双喜 陈石林 汪欣宇长沙市第一医院胃肠外科(长沙 410005)【摘要】目的分析LncRNA SNHG16靶向调控miR-516a-5p对结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法采用实时荧光RT-PCR检测lncRNA SNHG16、miR-516a-5p表达,构建抑制lncRNA SNHG16表达的SW480细胞,并对SW48
2、0细胞转染,分为NC组、si-NC组、si-SNHG16组、miR-NC组、miR-516a-5p组、si-SNHG16+anti-miR-NC 组、si-SNHG16+anti-miR-516a-5p 组,检测各组细胞增殖、凋亡侵袭、迁移情况。结果与癌旁组织相比,结直肠癌组织中lncRNA SNHG16表达水平升高,miR-516a-5p表达水平降低(P 0.05)。与FHC组相比,HCT116组、SW620组、SW480组细胞中lncRNA SNHG16表达水平升高,miR-516a-5p表达水平较低,且SW480组lncRNA SNHG16水平最高、miR-516a-5p水平最低(P 0
3、.05)。与si-NC组相比,si-SNHG16组lncRNA SNHG16表达水平降低(P 0.05),表明干扰lncRNA SNHG16表达的SW480细胞株构建成功,与 si-NC 组相比,si-SNHG16 组 CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD 值、迁移细胞数、侵袭细胞数降低,凋亡细胞升高(P 0.05)。与miR-NC组相比,miR-516a-5p组miR-516a-5p表达水平升高(P 0.05),表明高表达 miR-516a-5p 的 SW480 细胞株构建成功,与 miR-NC 组相比,miR-516a-5p 组 CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD 值
4、、迁移细胞数、侵袭细胞数降低,凋亡细胞升高(P 0.05)。双荧光素酶报告试验显示,与miR-NC组相比,miR-516a-5p可使SNHG16荧光素酶活性降低(P 0.05)。与si-NC组相比,抑制lncRNA SNHG16表达可使SW480细胞中miR-516a-5p表达、凋亡细胞升高,CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD 值、迁移细胞数、侵袭细胞数降低(P 0.05),与 si-SNHG16+anti-miR-NC组相比,si-SNHG16+anti-miR-516a-5p组miR-516a-5p表达、凋亡细胞降低,CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、迁移细胞数
5、、侵袭细胞数升高(P 0.05)。结论干扰lncRNA SNHG16表达,可对miR-516a-5p表达进行调控,抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移,并促进其凋亡。【关键词】结直肠癌;LncRNA SNHG16;miR-516a-5p;增殖;侵袭;迁移【中图分类号】R735The effect of targeted regulation of miR516a5p by LncRNA SNHG16 on the proliferation,invasion,and migration ability of colorectal cancer cells YANG Fengshuai,QIU Do
6、ngda,YANG Yunquan,GONG Shuangxi,CHEN Shilin,WANG Xinyu.Department of Gastrointestinal,Changsha First Hospital,Changsha 410005,China 【Abstract】Objective Analyze the effect of LncRNA SNHG16 targeted regulation of miR516a5p on the proliferation,invasion,and migration ability of colorectal cancer cells.
7、Methods Real time fluorescence RTPCR was used to detect the expression of lncRNA SNHG16 and miR516a5p,and SW480 cells were constructed to inhibit lncRNA SNHG16 expression.SW480 cells were transfected and divided into a NC group,a siNC group,a siSNHG16 group,a miRNC group,a miR516a5p group,a siSNHG16
8、+anti miRNC group,and a siSNHG16+anti miR516a5p group to detect cell proliferation,apoptosis,invasion,and migration in each group.Results Compared with adjacent tissues,the expression level of lncRNA SNHG16 in colorectal cancer tissue increased,while the expression level of miR516a5p decreased(P 0.0
9、5).Compared with the FHC group,the expression levels of lncRNA SNHG16 and miR516a5p were increased in the HCT116,SW620,and SW480 groups,while the expression levels of miR516a5p were lower.The SW480 group had the highest lncRNA SNHG16 and the lowest miR516a5p levels(P 0.05).Compared with the siNC gro
10、up,the expression level of lncRNA SNHG16 in the siSNHG16 group decreased(P 0.05),indicating the successful construction of SW480 cell lines that interfered with lncRNA SNHG16 expression.Compared with the siNC group,the siSNHG16 group showed a decrease in CyclinD1,MMP2,基 础 研 究doi:10.3969/j.issn.1006-
11、5725.2023.20.006基金项目:湖南省卫生健康委科研计划项目(编号:202204013155);长沙市2020年度指导性科技计划项目(编号:kzd2001091)2591实用医学杂志 2023年第39卷第20期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.20MMP9,OD value,number of migrating and invading cells,and an increase in apoptotic cells(P 0.05).Compared with the miRNC group,the miR516a5
12、p group showed an increase in miR516a5p expression levels(P 0.05),indicating the successful construction of SW480 cell lines with high expression of miR516a5p.Compared with the miRNC group,the miR516a5p group showed a decrease in CyclinD1,MMP2,MMP9,OD value,number of migrating cells,and number of in
13、vasive cells,while an increase in apoptotic cells(P 0.05).The dual luciferase report test showed that compared with the miRNC group,miR516a5p could reduce the luciferase activity of SNHG16(P 0.05).Compared with the siNC group,inhibiting the expression of lncRNA SNHG16 resulted in an increase in miR5
14、16a5p expression and apoptotic cells in SW480 cells,as well as a decrease in CyclinD1,MMP2,MMP9,OD value,number of migratory cells,and number of invasive cells(P 0.05).Compared with the siSNHG16+anti miRNC group,the siSNHG16+anti miR516a5p group showed a decrease in miR516a5p expression and apoptoti
15、c cells,while the cyclinD1,MMP2,MMP9,OD value,number of migratory cells,and number of invasive cells increased(P 0.05).Conclusion Interfering with lncRNA SNHG16 expression can regulate the expression of miR516a5p,inhibit the proliferation,invasion,migration,and promote apoptosis of colorectal cancer
16、 cells.【Key words】colorectal cancer;LncRNA SNHG16;miR516a5p;proliferation;invasion;transfer结直肠癌为消化道常见恶性肿瘤,临床发病率逐年升高,发病早期,患者无明显症状,多数患者确诊时已为晚期,可造成患者不良预后。结直肠癌临床发病机制复杂,故对其分子机制进行分析,寻找治疗结直肠癌新途径具有重要意义。临床研究显示,在结直肠癌发展过程中,LncRNA、miRNAs 可作为促癌、抑癌基因,对细胞的增殖、侵袭、凋亡进行调控1。lncRNA可对基因的转录进行调节,在肿瘤的发生、发展中作用较为重要,lncRNA SNH
17、G16 可促进多种肿瘤发展,且与肿瘤的分期、耐药具有一定相关性,可对机体内相关信号通路进行调节2。miR-516a-5p 在肝癌、肺癌、结直肠癌等多种肿瘤中表达下降,可对多种蛋白进行调节,进而控制细胞的增殖、迁移3。临床研究中,暂未有研究显示lncRNA SNHG16可靶向调控 miR-516a-5p 对结直肠癌细胞的增殖、迁移进行调节,基于此,本研究分析干扰 lncRNA SNHG16 调控 miR-516a-5p 对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响。1材料与方法1.1主要试剂人结直肠癌细胞系(HCT116、SW620、SW480)购自于上海抚生实业有限公司,结直肠上皮细胞FHC购自上海澳音生物
18、科技有限公司。DMEM 完全培养液(北京信生元生物医学科技有限公司);培养箱(杭州诺丁科学器材有限公司);电化学发光试剂盒(上海联硕生物科技有限公司);全蛋白提取试剂盒(昆山远慕生物科技有限公司);四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒(武汉益普生物科技有限公司);四甲基联苯胺(TMB)溶液(上海化邦生物科技有限公司);pcDNA、lncRNA SNHG16、anti-miR-NC、anti-miRNA-516a-5p、si-NC、si-SNHG16、miRNC、miRNA-516a-5p购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;CyclinD1、MMP-2、MMP-9、GADTH抗体购自上海延慕实业有限
19、公司。1.2标本来源选取2022年3月至2023年3月在医院进行手术治疗的20例结直肠癌患者,取患者结直肠癌组织、癌旁组织,该研究经患者、家属知情同意,经我院伦理委员会审核批准。1.3细胞培养将 FHC、HCT116、SW620、SW480细胞,均置于含 1%双抗、10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基中予以培养,此培养基内含10%的灭活的 FBS,在 CO2 5%37 的培养箱内予以培育,当细胞的融合度至80%时,选取胰蛋白酶(0.25%)对细胞进行消化,后对其实施传代培育,选用3次以上传代的对数生长期的细胞予以后续的试验。1.4细胞转染取 SW480 细胞,作为 NC 组,对SW480
20、 细胞转染 si-NC,作为 si-NC 组,对 SW480细胞做 SNHG16 抑制剂转染,作为 si-SNHG16 组,miR-NC 组为 SW480 细胞转染 miR-NC,miR-516a-5p 组为 SW480 细胞转染 miR-516a-5p 模拟物,si-SNHG16+anti-miR-NC组为SW480细胞做SNHG16抑制剂转染+anti-miR-NC,si-SNHG16+anti-miR-516a-5p 组 SW480 细胞做 SNHG16 抑制剂转染+miR-516a-5p抑制剂,分组后,继续对细胞培养,细胞融合度为80%后,进行转染,连续转染24 h。1.5检测方法1.
21、5.1lncRNA SNHG16、miR516a5p 表达水平检测提取癌组织、癌旁组织,放入液氮中研磨,根据试剂盒说明书提取总RNA,后转录为cDNA,采用 RT-PCR 对 lncRNA SNHG16、miR-516a-5p 表达量进行鉴定,反应条件:95 预变性3 min、95 2592实用医学杂志 2023年第39卷第20期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.20变性 5 s、56 退火 10 s,72 25,进行 40 个循环,72 10 min,采用 2-Ct方法计算出 lncRNA SNHG16、miR-516a-5p
22、 的 表 达 量。引 物 序 列见表1。1.5.2细胞增殖检测采用MTT比色法对细胞的增殖情况进行检测,对细胞的浓度进行调整,后将其接种于96孔板,加入0.2 mL细胞悬液,在37、5%CO2环境中培养,分别于24、48、72 h在其中添加0.01 mL MTT试剂,孵育4 h,后采用酶标仪测定490 nm处细胞OD值,对细胞增殖率进行计算,试验重复进行5次,结果取平均值。1.5.3细胞凋亡检测细胞凋亡情况通过TUNEL法进行测定,将所培养细胞做洗涤、DAPI 染色封片后的细胞核分别呈现为蓝色荧光(阴性细胞数)、绿色荧光(阳性细胞数),之后细胞凋亡情况采用荧光显微镜进行观察,细胞凋亡指数=凋亡
23、细胞数/总细胞数100%。试验重复测量3次。1.5.4细胞迁移情况检测细胞迁移能力通过进行划痕试验进行检测,选取SW480用胰蛋白酶分解,获取细胞悬液接种到6孔板上,所有单层细胞采用1.60 mL移液器枪头自上而下做一条划痕,刮下细胞用 PBS 缓冲液洗涤,向干净培养基中加入4 mL溶液,37 下培育29 h,弃去培养液,在显微镜下观察并记录视野平均值,重复3次,取细胞迁移数平均值。1.5.5细胞侵袭能力检测细胞侵袭能力通过Transwell 实验进行检测,在 Transwell 小室铺基质胶,24 孔板中加入 600 L 10%胎牛血清培养基,上室分别接种 100 L 各组细胞悬液,37、5
24、%CO2培养箱培养 18 h。滤膜用 4%多聚甲醛固定20 min。棉签擦去滤膜表面细胞,结晶紫染色,光镜下随机选 5 个视野,计算细胞总数,以穿过Matrigel 基质胶的细胞数来表示 SW480 的侵袭能力。循环3次,计算出SW480侵袭数总均值。1.5.6CyclinD1、MMP2、MMP9 检测采用Western Blot 法检测,将培养的 SW480 细胞放入离心管,将 RIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂加入,以12 000 r/min离心处理10 min,制作组织匀浆,取上层清液,使用BCA法对蛋白浓度测定,后取相同质量蛋白,放入 10%SDS-PAGE 凝胶中,进行电泳、转膜处理,后
25、采用 5%脱脂奶粉进行封管处理,放入 4 冰箱中,过夜处理,后进行清洗。加入CyclinD1、MMP-2、MMP-9 抗体,孵育 2 h,进行清洗,加入HRP标记二抗,室温下孵育3 h,凝胶成像系统下观察成像情况,计算恢复值,以GAPDH 为内参,对蛋白表达情况分析。1.5.7双荧光素酶报告试验采用 starBase 网站对预测 lncRNA SNHG16 表靶基因,结果显示,lncRNA SNHG16 中含有与 miR-516a-5p 互补核苷酸序列,包括 WT-lncRNA SNHG16、MUT-lncRNA SNHG16,将 WT-lncRNA SNHG16、MUT-lncRNA SNH
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