miR-4505靶向SOX-10在先天性巨结肠中的作用及机制.pdf
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1、实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18miR-4505靶向SOX-10在先天性巨结肠中的作用及机制吴凯 王健俊 何继贤 陈钦明 余岱岳 路羿 范凯斯 张梦真 杨六成南方医科大学珠江医院小儿外科(广州 510282)【摘要】目的探讨miR-4505在先天性巨结肠(HSCR)中的作用及分子机制。方法选取HSCR病变段肠管及扩张段肠管组织标本,qRT-PCR 检测组织标本 miR-4505 表达量;分别选用 miR-4505 模拟物及抑制剂转染人神经母细胞株 SH-SY5Y,qRT-PCR 检测
2、转染后 miR-4505 表达,CCK-8 及 Transwell 检测miR-4505对细胞增殖及细胞迁移的影响;生物信息学预测、双荧光素酶报告基因实验、Western blot 以及免疫组织化学在细胞及组织层面证实 SOX-10 是 miR-4505 的作用靶点。结果与扩张段肠管相比,HSCR 病变段肠管的 miR-4505 呈高频高表达(t=11.25,P 0.001);过表达 miR-4505 可以抑制细胞增殖及迁移,敲低其表达后细胞的增殖及迁移能力增强;靶基因预测及双荧光素酶报告基因检测证实miR-4505 可与 SOX-10 的 3-UTR 结合,Western blot 证实其可
3、降低细胞 SOX-10 蛋白含量,而免疫组化证实SOX-10在HSCR 病变段肠管中呈低表达。结论miR-4505在HSCR 病变段及扩张段肠管之间存在表达差异,miR-4505 可以抑制细胞的增殖及迁移,其在 HSCR 中发挥作用可能与抑制 SOX-10 基因表达有关。【关键词】先天性巨结肠;神经母细胞;miR-4505;SOX-10【中图分类号】R726miR-4505 downregulates cell proliferation and migration in Hirschsprung s disease by targeting SOX-10 WU Kai,WANG Jianju
4、n,HE Jixian,CHEN Qinming,YU Daiyue,LU Yi,FAN Kaisi,ZHANG Mengzhen,YANG Liucheng.Department of Pediatric Surgery,Zhujiang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510282,ChinaCorrsponding author:YANG Liucheng Email:【Abstract】ObjectiveTo explore the role and molecular mechanism of miR-4505 in
5、 Hirschsprung disease(HSCR).MethodsStenotic and dilated colon segments of HSCR patients operated at Zhujiang Hospital of Southern Medical University were collected.qRT-PCR was performed to detected the expression of miR-4505 in colon tissuesspecimens.The miR-NC,miR-4505 mimics and miR-4505 inhibitor
6、s were transfected into human neuroblastoma cell line SH-SY5Y,followed by qRT-PCR to examine the expression of miR-4505 after transfection,CCK-8 assay and Transwell assay to detect the effect of miR-4505 on the proliferation and migration of SH-SY5Y cells.The downstream target genes of miR-4505 were
7、 predicted through bioinformatics and detected by dual luciferase reporter gene assay;the target genes were verified by Western blot and Immunohistochemistry.ResultsmiR-4505 was highly expressed in the stenotic colon compared to the dilated segment(t=11.25,P 0.001).Overexpression of miR-4505 inhibit
8、ed cell proliferation and migration,and conversely,downregulation of miR-4505 enhanced cell proliferation and migration.Target gene prediction and dual-luciferase reporter gene assay suggested that the 3-UTR of SOX-10 was a direct target of miR-4505.Moreover,Western blot confirmed that miR-4505 decr
9、eased SOX-10 protein levels in cells,while immunohistochemistry proved that SOX-10 was lowly expressed in HSCR disease colontissues.ConclusionOur study demonstrated that miR-4505 was differentially expressed between the diseased and dilated segments of HSCR.miR-4505 could inhibited cell proliferatio
10、n and migration,and its role in HSCR may be achieved by suppressing the downstream SOX-10 gene expression.【Key words】hirschsprung disease;neural stem cell;miR-4505;SOX-10基 础 研 究doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2023.18.008基金项目:广东省自然科学基金项目(编号:2019A1515011086)通信作者:杨六成 Email:2330实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Jou
11、rnal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18先天性巨结肠(hirschsprung disease,HSCR)是一种常见的消化道畸形,发病率约为1/5 000 1/2 000,并有逐年增加的趋势,其发病机制尚未完全明确1-2。miRNA 是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA,其大小长约 20 25 个核苷酸,具有抑制靶 mRNA 转录、翻译或者能够剪切靶mRNA,促进其降解,在发育过程中起着重要作用。miRNA在HSCR中同样具有重要的作用,如miR-145-3p3、miR-192-5p、miR-200a-3p4、miR-14
12、8a-3p5、miR-2066等均被证实与HSCR的发生发展有着密切关系。前期我们采用微阵列miRNA芯片检测发现miR-4505在HSCR病变段肠管中高表达3,其在HSCR中的具体作用仍不明确。本研究将进一步证实miR-4505对细胞功能的影响,通过生物信息学及分子生物学实验阐明miR-4505的作用分子机制。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1 实验材料 收集自 2018 年至 2020 年期间在南方医科大学珠江医院行手术的HSCR病变段肠管及扩张段肠管组织标本,分别采用液氮及甲醛保存,所有组织标本均经病理检查确认,标本采集均经过医院伦理委员会批准,并签署知情同意书。人神经母细胞株SH-
13、SY5Y由中国科学院上海研究所细胞库提供。1.1.2 主要试剂 miR-4505-mimics、miR-4505-inhibitors及阴性对照(Negative control,NC)均为上海吉玛生物科技公司产品,LipolifectmineTM 2000购自美国 Thermofisher 公司。自美国 Invitrogen 公司购买 Trizol RNA 提取试剂盒,miRNeasy 抽提试剂盒为德国 Qiagen 公司产品,cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute miRNA 荧光定量试剂盒及相关引物购自北京天根生化科技有限公司(表1)。荧光素酶报告检测基因活性为美国 Promega
14、公司产品,野生型及突变型 SOX-10 质粒由广州锐博生物技术公司合成,CCK-8 为美国 GLPbio 公司产品,SOX-10 一抗及羊抗兔二抗均为美国 Abcam 公司产品。1.2实验方法1.2.1 细胞培养及转染 37 水浴中复温,离心后加入 5 mL 含 10%FBS 的 DMEM 培养基,接种于培养瓶中,置于37、5%CO2培养箱内孵育。待细胞生长良好进行传代培养。消化细胞,将终浓度20 pmol miR-4505mimics、miR-4505inhibitors、NC溶于50 L Opti-MEM中,混匀,将 1 L lipo2000 溶于 50 L Opti-MEM 中,混匀,接
15、种于96孔板中完成下一步实验。1.2.2 qRT-PCR 取细胞或研磨成粉末的组织标本,TRIzol裂解细胞获取总RNA,随即使用RNasey Mini Kit进行纯化,鉴定RNA纯度,电泳方法检测RNA完整性,总RNA于-80冰箱内保存。随后采用 SYBR Green I 荧光法检测 miRNA,步骤如下:(1)取含有目的 miRNA 总 RNA 2 g,给 miRNA 的 3 端加多聚 PolyA 尾,Oligo(dT)-Universal Tag 进行反转录,合成对应的cDNA,采用的条件为37,60 min,随后 95,5 min。(2)取 miRNA 第一链的 cDNA 液 2 L,
16、加入 miRNA qPCR Detection kit(SYBR Green),行荧光定量检测。反应条件:95 10 min,1个循环,94 20 s,60 34 s,共45个循环。以U6为内参,计算miR-4505的相对表达量。1.2.3 CCK8检测细胞增殖 对数生长期细胞按每孔 4 103细胞接种,加入 100 L 细胞培养液,分别将miR-4505 mimics,NC或miR-4505inhibitors,随后加入 LipolifectmainTM2000 转染,于 0、24、48、72、96 h显微镜观察细胞的生长情况,加入10 L CCK-8,使用酶标仪检测各孔 OD 值,记录吸光
17、度后绘制生长曲线。1.2.4 Transwell法检测细胞迁移 转染细胞以1 104个/孔的密度置入专用 24 孔板上孔,下层加入10%FBS培养基600 L,上层加入100 L的2%FBS完全培养基,37 孵育 72 h,随后吸弃上室培养液,4%多聚甲醛固定及0.5%结晶紫染色,显微镜下进行计数。1.2.5 双荧光素酶报告系统验证 miR-4505 的靶基因 使用miR-4505mimics、NC及野生型、突变型SOX-10质粒共转染细胞,转染后采用进行双荧光报告基因检测,48 h 后使用吸管吸去旧的培养液,加入报告基因细胞裂解液,将细胞刮离后转移至离心管内,高速离心,取裂解产物5 L,加入
18、100 L反应底物,检测荧光酶活性。随后再加入Stop&GloBReagent 100 L,检测读取数值后计算相对表达量。1.2.6 Western blot 裂解液裂解细胞后加入到EP管中,4 12 000 r/min高速离心25 min,上清分装保存。取出5 L蛋白,BCA法定量后加入蛋白上样缓表1miR-4505qRT-PCR的引物Tab.1Sequences of primers for miR-4505引物U6-ForwardU6-ReversemiR-4505-ForwardmiR-4505-Reverse序列CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCG
19、TCGGGCAGGCTGGGCTGCAGCCACAAAAGAGCACAAT2331实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18冲液,配置浓缩胶及分离胶,加入到上样孔,电泳。48 V电转50 min将蛋白转移至PVDF膜上,TBS漂洗,封闭液振荡4 h,加入1 1 000的SOX-10一抗,4 过夜,漂洗后加入稀释的二抗,加入ECL工作液,显影和定影后采用凝胶成像系统处理蛋白条带。1.2.7 免疫组化 取等量组织标本在60 下烤片2 h后进行脱蜡水化,使用蒸馏水冲洗,微波修复法修复抗原。随后加入过
20、氧化氢及山羊抗血清进行封闭,加入 SOX-10 一抗(1 1 000)4 孵育过夜,二抗37 孵育1 h,DAB显色后使用苏木素复染,二甲苯透明化处理后于显微镜下观察。阴性对照采用0.1 mol/L PBS替代一抗。1.3 统计学方法 使用Graphpad prism5.0进行作图,SPSS19.0 进行统计分析,多个样本比较采用One-way ANOVE,CCK-8的结果使用重复测量方差分析,两样本量之间比较采用独立样本t检验,两样本率的比较采用2检验,数据以均数标准差表示,以P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 HSCR 病变段及扩张段肠管组织标本中miR-4505 的表达 HSC
21、R 病变段肠管中 miR-4505的相对表达量为6.187 0.449,扩张段肠管的miR-4505的相对表达量为0.937 0.104,HSCR病变段肠管的miR-4505相对表达量高于扩张段肠管,差异有统计学意义(t=11.25,P=0.000)。2.2 qRT-PCR进一步验证转染后对人神经母细胞株的 miR-4505 表达影响 PCR 结果采用 one-way ANOVA方差分析,转染后各组的miR-4505表达量有明显差异,转染miR-4505 mimics 后SH-SY5Y 的miR-4505的表达量(12.22 1.146)较NC组(1.00 0.036)增加,而转染 miR-4
22、505 inhibitors 后细胞的miR-4505的表达量(0.196 0.046)下降,差异均有统计学意义(P 0.01)。2.3 CCK-8 法检测 miR-4505 对人神经母细胞株增殖的影响 各时间点的细胞增殖有差异(F时间=9.34,P 0.001),各处理组的细胞增殖也有差异(F处理组=79.00,P 0.001),时间和组别有交互效应(F交互=6.11,P=0.002)。miR-4505 mimics可使细胞的增殖能力减弱,这种趋势可随着时间延长而增强(P 0.05),而miR-4505 inhibitors可使细胞的增殖能力增强(P 0.05)。见表2。2.4 Transw
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