miR-4505靶向SOX-10在先天性巨结肠中的作用及机制.pdf

实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18miR-4505靶向SOX-10在先天性巨结肠中的作用及机制吴凯 王健俊 何继贤 陈钦明 余岱岳 路羿 范凯斯 张梦真 杨六成南方医科大学珠江医院小儿外科（广州 510282）【摘要】目的探讨miR-4505在先天性巨结肠（HSCR）中的作用及分子机制。方法选取HSCR病变段肠管及扩张段肠管组织标本，qRT-PCR 检测组织标本 miR-4505 表达量；分别选用 miR-4505 模拟物及抑制剂转染人神经母细胞株 SH-SY5Y，qRT-PCR 检测转染后 miR-4505 表达，CCK-8 及 Transwell 检测miR-4505对细胞增殖及细胞迁移的影响；生物信息学预测、双荧光素酶报告基因实验、Western blot 以及免疫组织化学在细胞及组织层面证实 SOX-10 是 miR-4505 的作用靶点。结果与扩张段肠管相比，HSCR 病变段肠管的 miR-4505 呈高频高表达（t=11.25，P 0.001）；过表达 miR-4505 可以抑制细胞增殖及迁移，敲低其表达后细胞的增殖及迁移能力增强；靶基因预测及双荧光素酶报告基因检测证实miR-4505 可与 SOX-10 的 3-UTR 结合，Western blot 证实其可降低细胞 SOX-10 蛋白含量，而免疫组化证实SOX-10在HSCR 病变段肠管中呈低表达。结论miR-4505在HSCR 病变段及扩张段肠管之间存在表达差异，miR-4505 可以抑制细胞的增殖及迁移，其在 HSCR 中发挥作用可能与抑制 SOX-10 基因表达有关。【关键词】先天性巨结肠；神经母细胞；miR-4505；SOX-10【中图分类号】R726miR-4505 downregulates cell proliferation and migration in Hirschsprung s disease by targeting SOX-10 WU Kai，WANG Jianjun，HE Jixian，CHEN Qinming，YU Daiyue，LU Yi，FAN Kaisi，ZHANG Mengzhen，YANG Liucheng.Department of Pediatric Surgery，Zhujiang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510282，ChinaCorrsponding author：YANG Liucheng Email：【Abstract】ObjectiveTo explore the role and molecular mechanism of miR-4505 in Hirschsprung disease（HSCR）.MethodsStenotic and dilated colon segments of HSCR patients operated at Zhujiang Hospital of Southern Medical University were collected.qRT-PCR was performed to detected the expression of miR-4505 in colon tissuesspecimens.The miR-NC，miR-4505 mimics and miR-4505 inhibitors were transfected into human neuroblastoma cell line SH-SY5Y，followed by qRT-PCR to examine the expression of miR-4505 after transfection，CCK-8 assay and Transwell assay to detect the effect of miR-4505 on the proliferation and migration of SH-SY5Y cells.The downstream target genes of miR-4505 were predicted through bioinformatics and detected by dual luciferase reporter gene assay；the target genes were verified by Western blot and Immunohistochemistry.ResultsmiR-4505 was highly expressed in the stenotic colon compared to the dilated segment（t=11.25，P 0.001）.Overexpression of miR-4505 inhibited cell proliferation and migration，and conversely，downregulation of miR-4505 enhanced cell proliferation and migration.Target gene prediction and dual-luciferase reporter gene assay suggested that the 3-UTR of SOX-10 was a direct target of miR-4505.Moreover，Western blot confirmed that miR-4505 decreased SOX-10 protein levels in cells，while immunohistochemistry proved that SOX-10 was lowly expressed in HSCR disease colontissues.ConclusionOur study demonstrated that miR-4505 was differentially expressed between the diseased and dilated segments of HSCR.miR-4505 could inhibited cell proliferation and migration，and its role in HSCR may be achieved by suppressing the downstream SOX-10 gene expression.【Key words】hirschsprung disease；neural stem cell；miR-4505；SOX-10基 础 研 究doi：10.3969/j.issn.1006-5725.2023.18.008基金项目：广东省自然科学基金项目（编号：2019A1515011086）通信作者：杨六成 Email：2330实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18先天性巨结肠（hirschsprung disease，HSCR）是一种常见的消化道畸形，发病率约为1/5 000 1/2 000，并有逐年增加的趋势，其发病机制尚未完全明确1-2。miRNA 是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA，其大小长约 20 25 个核苷酸，具有抑制靶 mRNA 转录、翻译或者能够剪切靶mRNA，促进其降解，在发育过程中起着重要作用。miRNA在HSCR中同样具有重要的作用，如miR-145-3p3、miR-192-5p、miR-200a-3p4、miR-148a-3p5、miR-2066等均被证实与HSCR的发生发展有着密切关系。前期我们采用微阵列miRNA芯片检测发现miR-4505在HSCR病变段肠管中高表达3，其在HSCR中的具体作用仍不明确。本研究将进一步证实miR-4505对细胞功能的影响，通过生物信息学及分子生物学实验阐明miR-4505的作用分子机制。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1 实验材料 收集自 2018 年至 2020 年期间在南方医科大学珠江医院行手术的HSCR病变段肠管及扩张段肠管组织标本，分别采用液氮及甲醛保存，所有组织标本均经病理检查确认，标本采集均经过医院伦理委员会批准，并签署知情同意书。人神经母细胞株SH-SY5Y由中国科学院上海研究所细胞库提供。1.1.2 主要试剂 miR-4505-mimics、miR-4505-inhibitors及阴性对照（Negative control，NC）均为上海吉玛生物科技公司产品，LipolifectmineTM 2000购自美国 Thermofisher 公司。自美国 Invitrogen 公司购买 Trizol RNA 提取试剂盒，miRNeasy 抽提试剂盒为德国 Qiagen 公司产品，cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute miRNA 荧光定量试剂盒及相关引物购自北京天根生化科技有限公司（表1）。荧光素酶报告检测基因活性为美国 Promega 公司产品，野生型及突变型 SOX-10 质粒由广州锐博生物技术公司合成，CCK-8 为美国 GLPbio 公司产品，SOX-10 一抗及羊抗兔二抗均为美国 Abcam 公司产品。1.2实验方法1.2.1 细胞培养及转染 37 水浴中复温，离心后加入 5 mL 含 10%FBS 的 DMEM 培养基，接种于培养瓶中，置于37、5%CO2培养箱内孵育。待细胞生长良好进行传代培养。消化细胞，将终浓度20 pmol miR-4505mimics、miR-4505inhibitors、NC溶于50 L Opti-MEM中，混匀，将 1 L lipo2000 溶于 50 L Opti-MEM 中，混匀，接种于96孔板中完成下一步实验。1.2.2 qRT-PCR 取细胞或研磨成粉末的组织标本，TRIzol裂解细胞获取总RNA，随即使用RNasey Mini Kit进行纯化，鉴定RNA纯度，电泳方法检测RNA完整性，总RNA于-80冰箱内保存。随后采用 SYBR Green I 荧光法检测 miRNA，步骤如下：（1）取含有目的 miRNA 总 RNA 2 g，给 miRNA 的 3 端加多聚 PolyA 尾，Oligo（dT）-Universal Tag 进行反转录，合成对应的cDNA，采用的条件为37，60 min，随后 95，5 min。（2）取 miRNA 第一链的 cDNA 液 2 L，加入 miRNA qPCR Detection kit（SYBR Green），行荧光定量检测。反应条件：95 10 min，1个循环，94 20 s，60 34 s，共45个循环。以U6为内参，计算miR-4505的相对表达量。1.2.3 CCK8检测细胞增殖 对数生长期细胞按每孔 4 103细胞接种，加入 100 L 细胞培养液，分别将miR-4505 mimics，NC或miR-4505inhibitors，随后加入 LipolifectmainTM2000 转染，于 0、24、48、72、96 h显微镜观察细胞的生长情况，加入10 L CCK-8，使用酶标仪检测各孔 OD 值，记录吸光度后绘制生长曲线。1.2.4 Transwell法检测细胞迁移 转染细胞以1 104个/孔的密度置入专用 24 孔板上孔，下层加入10%FBS培养基600 L，上层加入100 L的2%FBS完全培养基，37 孵育 72 h，随后吸弃上室培养液，4%多聚甲醛固定及0.5%结晶紫染色，显微镜下进行计数。1.2.5 双荧光素酶报告系统验证 miR-4505 的靶基因 使用miR-4505mimics、NC及野生型、突变型SOX-10质粒共转染细胞，转染后采用进行双荧光报告基因检测，48 h 后使用吸管吸去旧的培养液，加入报告基因细胞裂解液，将细胞刮离后转移至离心管内，高速离心，取裂解产物5 L，加入100 L反应底物，检测荧光酶活性。随后再加入Stop&GloBReagent 100 L，检测读取数值后计算相对表达量。1.2.6 Western blot 裂解液裂解细胞后加入到EP管中，4 12 000 r/min高速离心25 min，上清分装保存。取出5 L蛋白，BCA法定量后加入蛋白上样缓表1miR-4505qRT-PCR的引物Tab.1Sequences of primers for miR-4505引物U6-ForwardU6-ReversemiR-4505-ForwardmiR-4505-Reverse序列CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGTCGGGCAGGCTGGGCTGCAGCCACAAAAGAGCACAAT2331实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18冲液，配置浓缩胶及分离胶，加入到上样孔，电泳。48 V电转50 min将蛋白转移至PVDF膜上，TBS漂洗，封闭液振荡4 h，加入1 1 000的SOX-10一抗，4 过夜，漂洗后加入稀释的二抗，加入ECL工作液，显影和定影后采用凝胶成像系统处理蛋白条带。1.2.7 免疫组化 取等量组织标本在60 下烤片2 h后进行脱蜡水化，使用蒸馏水冲洗，微波修复法修复抗原。随后加入过氧化氢及山羊抗血清进行封闭，加入 SOX-10 一抗（1 1 000）4 孵育过夜，二抗37 孵育1 h，DAB显色后使用苏木素复染，二甲苯透明化处理后于显微镜下观察。阴性对照采用0.1 mol/L PBS替代一抗。1.3 统计学方法 使用Graphpad prism5.0进行作图，SPSS19.0 进行统计分析，多个样本比较采用One-way ANOVE，CCK-8的结果使用重复测量方差分析，两样本量之间比较采用独立样本t检验，两样本率的比较采用2检验，数据以均数标准差表示，以P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 HSCR 病变段及扩张段肠管组织标本中miR-4505 的表达 HSCR 病变段肠管中 miR-4505的相对表达量为6.187 0.449，扩张段肠管的miR-4505的相对表达量为0.937 0.104，HSCR病变段肠管的miR-4505相对表达量高于扩张段肠管，差异有统计学意义（t=11.25，P=0.000）。2.2 qRT-PCR进一步验证转染后对人神经母细胞株的 miR-4505 表达影响 PCR 结果采用 one-way ANOVA方差分析，转染后各组的miR-4505表达量有明显差异，转染miR-4505 mimics 后SH-SY5Y 的miR-4505的表达量（12.22 1.146）较NC组（1.00 0.036）增加，而转染 miR-4505 inhibitors 后细胞的miR-4505的表达量（0.196 0.046）下降，差异均有统计学意义（P 0.01）。2.3 CCK-8 法检测 miR-4505 对人神经母细胞株增殖的影响 各时间点的细胞增殖有差异（F时间=9.34，P 0.001），各处理组的细胞增殖也有差异（F处理组=79.00，P 0.001），时间和组别有交互效应（F交互=6.11，P=0.002）。miR-4505 mimics可使细胞的增殖能力减弱，这种趋势可随着时间延长而增强（P 0.05），而miR-4505 inhibitors可使细胞的增殖能力增强（P 0.05）。见表2。2.4 Transwell检测miR-4505对人神经母细胞株迁移的影响 Transwell法检测发现上调miR-4505的表达后细胞的迁移至下孔的细胞数为 16.00 2.280，而 阴 性 对 照 组 为 48.20 6.344，而 抑 制miR-4505 表达后迁移至下层的细胞数为 68.00 4.940，miR-4505 可以抑制细胞迁移。采用 one-way ANOVA 方差分析进行统计学处理：结果提示各处理组之间差异有统计学意义（F=8.40，P=0.008）。见图1。2.5 双荧光素酶报告基因证实 miR-4505 与靶基因SOX-10的作用关系 与突变型SOX-10质粒相比，野生型SOX-10质粒可以降低miR-4505的表达（t=11.19，P 0.001）。见表3。2.6 Western blot证实miR-4505可下调细胞SOX-10 的表达 上调细胞 miR-4505 的表达后细胞的SOX-10 蛋白含量（0.298 0.021）较阴性对照组表2CCK-8检测miR-4505对细胞增殖的影响Tab.2The effect of miR-4505 on cell proliferation was detected by CCK-8x s分组miR4505 mimicsNCmiR4505 inhibitors0 h0.282 0.0130.285 0.0150.285 0.01324 h0.333 0.0290.345 0.0300.358 0.02648 h0.385 0.0380.452 0.0390.489 0.04272 h0.448 0.0420.548 0.0460.587 0.05196 h0.490 0.0480.641 0.0520.712 0.058ABC注：A，miR-4505mimics；B，NC；C，miR-4505inhibitors图1Transwell检测miR-4505对细胞迁移的影响Fig.1The effect of miR-4505 on cell migration was detected by Transwell2332实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18（0.455 0.025）降低，SOX-10蛋白条带强度较浅，反之下调 miR-4505 的表达后细胞的SOX-10蛋白表达（0.559 0.019）升高，SOX-10 蛋白条带增粗，条带灰度值经内参校正后采用 one-way ANOVA方差分析进行统计学处理，结果显示各组差异有统计学意义（F=76.23，P=0.000 7）。见图2。2.7 免疫组化证实SOX-10在HSCR狭窄段肠管中低表达 HSCR狭窄段肠管中仅有4例有SOX-10表达，均呈弱阳性（10.0%），而其余 36 例 HSCR 患者狭窄段肠管的 SOX-10 表达为阴性（90.0%），而扩张段肠管 SOX-10 表达均呈强阳性（100%），两组比较差异有统计学意义（2=80.00，P 0.001）。3讨论肠神经系统发育异常被认为是导致HSCR的主要原因，遗传因素及环境因素均可使胚胎发育过程中的肠神经母细胞增殖、迁移及分化能力下降，使得肠神经母细胞在肠管发育过程中质量及数量不能达到标准，远端肠管出现神经节细胞缺如，形成HSCR7。RET、GDNF、GFRa1、EDNRB、EDN3、SOX-l0、Sema3d、KIF26A、PHOX2B 等均被证实与HSCR形成有关8-11。尽管有较多研究，当前对 HSCR 的认识还不够充分，当前已知基因只能解释HSCR中约50的家系病例和20的散发病例12。miRNA 在生长发育过程中起着重要的作用。近年来，国内外也有很多研究证明miRNA在HSCR形成过程中起着重要作用。如 WANG 等13发现miR-195-5p通过靶向GFRA4抑制神经母细胞的增殖和侵袭，参与HSCR 形成。JI等14发现miR-92a可以通过调节KLF4/PI3K/AKT通路抑制细胞的活力和迁移能力而在HSCR中发挥作用。前期我们采用基因芯片检测发现miR-4505在HSCR病变段肠管中高表达3。miR-4505在HSCR中的具体作用并不清楚，过往研究表明miR-4505在胃癌、口腔癌、焦虑症等多种疾病中均存在异常表达，其作为一个调控基因广泛参与细胞增殖、分化、迁移及凋亡的调控。LIN等15发现LCN-1可以抑制miR-4505调控CAIX影响口腔癌细胞增殖及迁移。ZHANG等16发现miR4505可下调HSPA12B的表达，加重LPS诱导的血管内皮细胞损伤。KIM等17证实miR-4505的表达与黏膜内胃癌淋巴结转移有着密切关系。我们的研究结果同样发现 miR-4505 在 HSCR 病变段肠管中高表达，过表达miR-4505可抑制细胞增殖及迁移，而敲低miR-4505可促进细胞增殖及迁移。miR-4505 是一个重要调节因子，在胚胎发育过程中可影响肠神经母细胞功能，参与 HSCR形成。miRNA本身并不能编码蛋白，与靶基因的3-UTR 结合抑制 mRNA 翻译，降解 mRNA 以及调控转录是其中非常重要的作用方式。细胞不同，miR-4505可与不同的靶基因结合发挥不同作用。SOX-10在外周神经系统发育中起着重要的作用，我们前期的研究表明 SOX-10 在正常肠管肌间神经丛的神经元及胶质神经细胞中均有表达，而在HSCR无神经节肠管呈一致性降低18。通过敲除小鼠 SOX-10 的等位基因将导致小鼠结肠末端神经节细胞缺陷症19。而基因分析表明，在SOX-10 结合位点中存在EDNRB的结合区，SOX-10可以调控 RET 基因的表达，进而影响外周神经元的增殖、分化及迁移20。因此，SOX-10 是肠神经系统发育中的重要上游调控因子，SOX-10异常是导致 HSCR形成的重要原因。本研究利用TargetScan及miRBase 预测 miR-4505 的靶基因，初步确定 SOX-10 作为 miR-4505 的潜在靶基因。随后采用双荧光素酶报告基因实验证实 miR-4505 可以与 SOX-10的3-UTR结合影响SOX-10的表达。而在组织标本中我们同样发现SOX-10在HSCR病变段肠管中低表达，进一步证实 miR-4505 在 HSCR 中发挥作用可能与抑制SOX-10表达有关。综上所述，我们的研究表明miR-4505与HSCR发病密切相关，其发挥作用可以与调控SOX-10的表达影响神经母细胞增殖及迁移，导致肠神经系统发育障碍有关。本研究为HSCR的诊治提供了新思路。本研究仍存在局限性，miR-4505对肠神表3双荧光素酶报告检测miR-4505与SOX-10的3-UTR的关系Tab.3Relationship between miR-4505 and the 3-UTR of SOX-10 was detected by dual luciferase reportsx s分组野生型SOX10突变型SOX10miR4505 mimics0.214 0.0651.020 0.082NC1.081 0.1021.142 0.121miR4505 mimicsNCmiR4505 inbihitorsSOX10actin图2Western blot检测miR-4505对细胞SOX-10蛋白含量的影响Fig.2The effect of miR-4505 on the SOX-10 protein wasdetected by Western blot2333实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18经干细胞确切作用以及在体内具体的作用机制仍有待进一步研究。【Author contributions】WU Kai designed experiment and wrote the article.WANG Jianjun，CHEN Qinming，HE Jixian，YU Daiyue，LU Yi performed the experiments and collected data.ZHANG Mengzhen，FAN Kaisi completed statistics.YANG Liucheng guided the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.参考文献1 MUELLER J L，GOLDSTEIN A M.The science of Hirschsprung disease：What we know and where we are headed J.Semin Pediatr Surg，2022，31（2）：151157.2 伍耀豪，曾乐祥，邱荣林，等.改良腹腔镜Swenson与Soave术对儿童短段型先天性巨结肠疗效差异 J.实用医学杂志，2018，34（12）：2015-2018.3 吴凯，陈钦明，王健俊，等.MicroRNA-145-3p在先天性巨结肠中的作用及机制研究 J.中国现代医学杂志，2020，30（6）：18-23.4 HONG M，LI X，LI Y，et al.Hirschsprungs disease：key microRNAs and target genesJ.Pediatr Res，2022，92（3）：737-747.5 LI L，LI X，WANG X，et al.Aberrant expression of LINC00346 regulates cell migration and proliferation via competitively binding to miRNA-148a-3p/Dnmt1 in Hirschsprungs disease J.Pediatr Surg Int，2022，38（9）：1273-1281.6 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