5-氟-胞苷抗肿瘤活性及其机制研究.pdf
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1、2023年9月第6 0 卷第5期四川大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan University(Natural Science Edition)Sep.2023Vol.60No.55-氟-胞苷抗肿瘤活性及其机制研究王绍昕,秦尽童,黄震(四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都6 10 0 6 5)摘要:为进一步探求高效、广谱的抗肿瘤氟代化学修饰小分子药物,为癌症治疗提出新的解决方案,本研究通过分子对接技术和细胞活性、流式细胞、转录组分析、DNA损伤等实验来探索氟修饰核苷类分子5-氟胞苷的抗肿瘤活性及其作用机制.实验结果表明,5-氟胞苷在多种肿瘤细胞中的
2、ICso小于1 mol/L,且5-F-Cyd较为明显地调节了癌症的发生与发展机制,与影响DNA复制、造成DNA损伤和诱导细胞凋亡有关.此外,还发现氟原子修饰的5-氟胞苷有可能通过干扰聚合酶的修复功能来阻止耐药的发生。因此,5-氟胞苷可作为癌症治疗的潜在候选药物.关键词:核苷类药物;抗肿瘤;凋亡;DNA损伤中图分类号:Q291The antitumor activity and mechanism of 5-fluoro-cytidine文献标识码:ADOI:10.19907/j.0490-6756.2023.056002WANG Shao-Xin,QIN Tong,HUANG Zhen(Key
3、 Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Educaion,College of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610065,China)Abstract:To further explore efficient and broad-spectrum anti-tumor fluorinated chemically modifiedsmall molecule drugs and propose new solutions for cancer thera
4、py,this study explored the antitumoractivity and mechanism of fluorine-modified nucleoside analog molecule 5-fluorocytidine by moleculardocking technique and cell activity,flow cytometry,transcriptome analysis,DNA damage.The experi-mental results showed that the ICso of 5-fluorocytidine in a variety
5、 of tumor cells is less than 1 mol/L.Moreover,5-F-Cyd significantly regulates the occurrence and development of cancer,affecting DNA rep-lication,causing DNA damage,and inducing cell apoptosis.In addition,it was found that fluorine-at-om-modified 5-fluoro-cytidine has the potential to prevent the de
6、velopment of drug resistance by interfer-ing with the repair function of polymerase o.In conclusion,5-fluorocytidine may serve as a potentialdrug candidate for cancer therapy.Keywords:Nucleoside analogs;Antitumor;Apoptosis;DNA damage究机构(International Agency for Research on1 引 言Cancer,IARC)公布的数据,中国以4
7、57 万病例位作为世界上第二大致死病因,癌症的患病率和居2 0 2 0 年癌症新发人数的国家榜首,美国和印度病死率逐年升高.根据世界卫生组织国际癌症研分别以2 2 8 万和132 万居第二和第三位2 1.短短六收稿日期:2 0 2 3-0 4-13基金项目:西南特色中药资源国家重点实验室开放基金(SKLTCM202202,2 0 2 2/0 9-2 0 2 3/0 8)作者简介:王绍昕(1998-),女,山东临沂人,硕士研究生,研究方向为细胞生物学,E-mail:12 50 6 8 8 7 0 6 q q.c o m通讯作者:黄震.zhen_056002-1第6 0 卷年时间,中国新发癌症病例
8、就从2 0 16 年的40 6.4万例,增至2 0 2 2 年的48 2 万例,增幅高达18.6%3.在目前我们已知的癌症中,胰腺癌因其诊断、治疗难度高及低生存率被称为“癌症之王”随着对癌症发病机制探索与完善,各种肿瘤的治疗得到了长足的发展,但胰腺癌的诊断与治疗在近年来几乎没有变化幻.因此,本研究计划以胰腺癌细胞株(PANC-1)进行主要的机制探索,为胰腺癌治疗提供新思路。化疗是目前癌症治疗最常见和最有效的主要方法之一5.根据美国疾病控制与预防中心(Cen-ters for Disease Control and Prevention,CDC)的数据,美国每年约有6 5万名癌症患者在门诊癌症治
9、疗中接受化疗.根据作用机制不同,抗癌化疗药物分为以下六种:a)造成DNA损伤的烷基化剂;b)掺人DNA或RNA合成链中,引起链合成中断的链终止剂;c)聚合酶或与核苷酸合成相关酶的活性抑制剂;d)拓扑异构酶I或 II 的抑制剂;e)有丝分裂和细胞分裂的抑制剂;f)治疗癌症和减轻其他药物副作用的皮质类固醇6.其中,核苷类小分子的主要机制是作为核苷酸合成相关酶的活性抑制剂,干扰核苷酸的合成;作为DNA或RNA合成的底物,或作为聚合酶抑制剂与聚合酶紧密结合,干扰其正常功能的行使,从而引起新生DNA或RNA链合成的终止7.随着新冠病毒爆发,人们又开始关注核苷类药物的抗病毒机理.核苷的修饰可引起其结构、稳
10、定性和选择性变化,从而具有抗病毒或抗癌的效力8.需要指出的是,从核苷的结构来看,抗病毒和抗肿瘤并没有绝对严格的区分9.氟原子修饰的核苷类药物,由于可以提高药物选择性、有效性及递送效率等优势,已成为主要的修饰策略之一此外,该类药物还具有易于合成、储存、运输和标准化等优点10 1.氟代药物已经被用于癌症、艾滋病毒、疟疾和天花感染在内的多种疾病治疗11,5-氟胞苷(5-F-Cyd)作为一种氟代核苷类药物,在临床上被广泛应用于酵母和真菌感染的治疗,其基本机制为先脱氨,转变成为5-氟尿苷,然后代谢为其它尿苷类似物,并且少量被转化为5-氟胞苷三磷酸,随后被掺人RNA合成链,进而终止RNA合成12.有研究表
11、明,氟胞苷和氟脱氧胞苷对的人宫颈癌细胞株的生长具有较强抑制作用13.因此,我们计划对其抗肿瘤机制进行进一步的研究,以便进一步探求高效、广谱的抗肿瘤氟代化学修饰小分子药物,为癌症治疗提出新的广谱解四川大学学报(自然科学版)决方案2材料和方法2.1实验材料PANC-1 细胞、LNCaP 细胞、MCF-7 细胞、PC-3细胞购自中科院上海细胞所;细胞培养皿、96孔板、离心管购自Corning公司(中国);DMEM培养基、PBS缓冲液、胰酶购自Hyclone公司(美国);澳洲胎牛血清购自Thermo fisher公司(美国);DMSO、C e llC o u n tin g K it-8 试剂盒购自上
12、海碧云天生物技术有限公司.2.2实验方法2.2.1小分子核苷药物的细胞活性实验取对数期生长的PANC-1细胞,胰酶消化后离心,弃上清,含有10%FBS的DMEM培养基重悬后计数,根据计数结果9 6 孔板铺板.每孔约350 0 个细胞(具体数目根据预实验确定),各实验组、阴性对照组和阳性对照组设5个复孔,1个空白组作为背景.37 培养箱过夜培养贴壁,细胞融合度为30%40%时药物处理,按浓度梯度(1nmol/L、10 nmol/L、10 0 n m o l/L、1 mol/L和 10 mol/L浓度)给药,继续培养48 h后,CCK8处理后测定吸光度.2.2.25-F-Cyd的流式细胞实验使用1
13、0 mol/L的5-F-Cyd,以及吉西他滨处理PANC-1细胞48 h,阴性对照组使用 PBS 处理.经 Annexin V-FITC细胞调亡检测试剂盒处理染色后,上机检测.2.2.3转录组测序PANC-1细胞与10 mol/L浓度的 5-F-Cyd 以及未经处理的阴性对照组(NC)共同孵育48 h后,用Trizol试剂将细胞从培养板吹打至2 mL离心管,存于一8 0 或直接送检.2.2.4DNA损伤实验用96 孔板铺板,每孔1X104个PANC-1细胞,过夜贴壁给药47 h(50 mol/L、30 mol/L、2 0 mol/L Capecit-abine,C i s p la t i n
14、,BO,B2)使用DNA损伤试剂盒处理后,用荧光显微镜观察并拍照。2.2.5分子对接在PDB下载蛋白质结构,使用autodock tools预处理小分子结构和蛋白质结构,并设定grid,使用 autodock vina 进行虚拟对接以及用pymol分析结果.3结果与分析3.15-氟-胞苷对癌细胞增殖的作用使用经化学合成的5-氟-胞嘧啶(5-F-Cyto-056002-2第5期第5期sine,5-F-C y t)和 5-氟-胞苷(5-F-Cytidine,5-F-Cyd)在胰腺癌细胞PANC-1,乳腺癌细胞 MCF-7,前列腺癌细胞 LNcap 和 PC-3等多种癌细胞系中进行细胞增殖实验,化合
15、物结构如图1所示.细胞活性实验使用吉西他滨(Gemcitabine,Gem)作为对照,设置五个药物浓度,经不同化合物处理48 h的细胞,使用CCK8检测细胞增殖速率(图2).实验结果表明,在多种癌细胞系中,5-F-Cyd均显示出良好的细胞增殖抑制效果,且5-F-Cyd 的活性优于广谱化疗药物吉西他滨.此外,5-F-Cyd在PANC-1、M CF-7、LNc a P细胞系中的 ICso分别为0.19 mol/L、0.8 5 mol/L和0.6 0 mol/L,展现出显著抑制肿瘤细胞增殖的活性.NH2HO.5-F-Cyt图1氟代小分子的化学结构式Fig.1 Chemical structure o
16、f fluorinated small molecule(a)1.010.80.60.40.20.0+0(c)1.00.80.60.40.20.00(ad):G e m、5-F-Cy t、5-F-Cy d 在不同药物浓度(log)下对多种癌细胞系的增殖抑制作用。*P0.0002,*P 0.0 0 0 1Fig.2 The proliferation inhibitory activity of fluorinated small molecules in different cancer cell lines(ad):Proliferation inhibition of Gem,5-F-Cy
17、t,and 5-F-Cyd in various cancer cell lines at different drug concentrations(log).*P0.0002,*P10MCF-710OHOH5-F-CydPANC-1*12345log.concentration/(nmol/L)LNcaP12log concentration/(nmol/L)图2 氟代小分子在不同癌细胞系中的增殖抑制活性第6 0 卷3.25-氟-胞苷处理后的转录组测序结果分析对其处理的 PANC-1 细胞进行了转录组测序,并对差异基因进行KEGG聚类分析,选取显著性最高的2 0 个基因绘制不同通路的基因表
18、达差异图(图3).5-F-Cyd处理后,DNA复制、DNA损伤与修复、细胞周期、细胞凋亡以及与癌症相关的多条通路均有上调,显示5-F-Cyd较为明显的调节了癌症的发生与发展,且机制与影响DNA复制、造成DNA损伤和诱导细胞凋亡有关;同时,有机物的代谢以及胞质、细胞器代谢、蛋白质结合等通路发生了下调,说明5-F-Cyd影响或阻碍了细胞的正常代谢过程。表1核苷类似物药物的ICso(单位:mol/L)Tab.1 The ICso of six nucleoside analogs(unit:mol/L)细胞系PANC-1LNcaPPC-3(b)1.00.80.60.40.20.0+0(d)1.010
19、.80.6*0.40.20.0+34Gem1010MCF-71234F5log concentration/(nmol/L)PC-301log concentration/(nmol/L)5-F-Cyd0.190.850.610*235-F-Cyt10101010Gem5-F-Cyt5-F-Cyd45056002-3第6 0 卷(a)Transciptional misreguatonin cancerTNF signaling patwaySplicoosome-RNA transpot-RibosomeProteinprocessingin endoplasmic reticulumPI3
20、K-Akt signaling pathwayp53signaling pathwayNOD-ike receptor signaling pathwayNF-kappa Bsignaling pathwaymRNAsurvellance pathwayMismatchrepairMAPK signaling pathwayHTLV-linfectionHippo signaling pathwayHepalisBEpstoin-Barr virus infoction-DNAreplicatonCeloycle-Apoptosis图35-F-Cyd差异表达基因的聚类分析(a)上调通路;(b)
21、下调通路Fig.3 Cluster analysis of differentially expressed genes in 5-F-Cyd(a)up-regulated pathway;(b)down-regulation pathway3.35-氟-胞苷的DNA损伤好相关性,因此磷酸化H2AX(-H 2 A X)是检测基于转录组测序中,5-F-Cyd处理后关于DNA损伤及其修复的敏感标记物.结果显示,5-F-DNA损伤和修复途径差异表达的结果,为验证其Cyd处理后的细胞产生了强烈DNA损伤荧光,说是否会造成DNA损伤,本研究用磷酸化H2AX明与转录组测序结果一致,5-F-Cyd确可引起(
22、-H2AX)作为损伤标志物来检测DNA损伤情况DNA损伤.(DNA双链断裂).DNA双链断裂损伤(DNA3.45-氟-胞苷的三磷酸形式与polQ的虚拟对接double strand break damage,DSB)是最危险的DNA损伤实验表明,5-F-Cyd可引起DNA双DNA损伤类型之一.哺乳动物细胞中对DSB的首链断裂损伤,该损伤可通过DNA聚合酶 theta(pol0)介导的末端连接(TMEJ)进行修复.有研究表NCCis四川大学学报(自然科学版)(b)single-organismcellular process.protoin binding-organic substance m
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- 胞苷抗 肿瘤 活性 及其 机制 研究
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