5-氟-胞苷抗肿瘤活性及其机制研究.pdf

2023年9月第6 0 卷第5期四川大学学报（自然科学版）Journal of Sichuan University(Natural Science Edition)Sep.2023Vol.60No.55-氟-胞苷抗肿瘤活性及其机制研究王绍昕，秦尽童，黄震（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都6 10 0 6 5）摘要：为进一步探求高效、广谱的抗肿瘤氟代化学修饰小分子药物，为癌症治疗提出新的解决方案，本研究通过分子对接技术和细胞活性、流式细胞、转录组分析、DNA损伤等实验来探索氟修饰核苷类分子5-氟胞苷的抗肿瘤活性及其作用机制.实验结果表明，5-氟胞苷在多种肿瘤细胞中的ICso小于1 mol/L,且5-F-Cyd较为明显地调节了癌症的发生与发展机制，与影响DNA复制、造成DNA损伤和诱导细胞凋亡有关.此外，还发现氟原子修饰的5-氟胞苷有可能通过干扰聚合酶的修复功能来阻止耐药的发生。因此，5-氟胞苷可作为癌症治疗的潜在候选药物.关键词：核苷类药物；抗肿瘤；凋亡；DNA损伤中图分类号：Q291The antitumor activity and mechanism of 5-fluoro-cytidine文献标识码：ADOI:10.19907/j.0490-6756.2023.056002WANG Shao-Xin,QIN Tong,HUANG Zhen(Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Educaion,College of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610065,China)Abstract:To further explore efficient and broad-spectrum anti-tumor fluorinated chemically modifiedsmall molecule drugs and propose new solutions for cancer therapy,this study explored the antitumoractivity and mechanism of fluorine-modified nucleoside analog molecule 5-fluorocytidine by moleculardocking technique and cell activity,flow cytometry,transcriptome analysis,DNA damage.The experi-mental results showed that the ICso of 5-fluorocytidine in a variety of tumor cells is less than 1 mol/L.Moreover,5-F-Cyd significantly regulates the occurrence and development of cancer,affecting DNA rep-lication,causing DNA damage,and inducing cell apoptosis.In addition,it was found that fluorine-at-om-modified 5-fluoro-cytidine has the potential to prevent the development of drug resistance by interfer-ing with the repair function of polymerase o.In conclusion,5-fluorocytidine may serve as a potentialdrug candidate for cancer therapy.Keywords:Nucleoside analogs;Antitumor;Apoptosis;DNA damage究机构（International Agency for Research on1 引 言Cancer,IARC)公布的数据，中国以457 万病例位作为世界上第二大致死病因,癌症的患病率和居2 0 2 0 年癌症新发人数的国家榜首，美国和印度病死率逐年升高.根据世界卫生组织国际癌症研分别以2 2 8 万和132 万居第二和第三位2 1.短短六收稿日期：2 0 2 3-0 4-13基金项目：西南特色中药资源国家重点实验室开放基金（SKLTCM202202，2 0 2 2/0 9-2 0 2 3/0 8）作者简介：王绍昕（1998-），女，山东临沂人，硕士研究生，研究方向为细胞生物学，E-mail：12 50 6 8 8 7 0 6 q q.c o m通讯作者：黄震.zhen_056002-1第6 0 卷年时间，中国新发癌症病例就从2 0 16 年的40 6.4万例，增至2 0 2 2 年的48 2 万例，增幅高达18.6%3.在目前我们已知的癌症中,胰腺癌因其诊断、治疗难度高及低生存率被称为“癌症之王”随着对癌症发病机制探索与完善，各种肿瘤的治疗得到了长足的发展，但胰腺癌的诊断与治疗在近年来几乎没有变化幻.因此,本研究计划以胰腺癌细胞株(PANC-1)进行主要的机制探索，为胰腺癌治疗提供新思路。化疗是目前癌症治疗最常见和最有效的主要方法之一5.根据美国疾病控制与预防中心（Cen-ters for Disease Control and Prevention,CDC)的数据，美国每年约有6 5万名癌症患者在门诊癌症治疗中接受化疗.根据作用机制不同，抗癌化疗药物分为以下六种：a)造成DNA损伤的烷基化剂；b）掺人DNA或RNA合成链中，引起链合成中断的链终止剂;c)聚合酶或与核苷酸合成相关酶的活性抑制剂;d)拓扑异构酶I或 II 的抑制剂;e)有丝分裂和细胞分裂的抑制剂;f)治疗癌症和减轻其他药物副作用的皮质类固醇6.其中，核苷类小分子的主要机制是作为核苷酸合成相关酶的活性抑制剂，干扰核苷酸的合成；作为DNA或RNA合成的底物，或作为聚合酶抑制剂与聚合酶紧密结合，干扰其正常功能的行使，从而引起新生DNA或RNA链合成的终止7.随着新冠病毒爆发，人们又开始关注核苷类药物的抗病毒机理.核苷的修饰可引起其结构、稳定性和选择性变化，从而具有抗病毒或抗癌的效力8.需要指出的是，从核苷的结构来看,抗病毒和抗肿瘤并没有绝对严格的区分9.氟原子修饰的核苷类药物，由于可以提高药物选择性、有效性及递送效率等优势，已成为主要的修饰策略之一此外，该类药物还具有易于合成、储存、运输和标准化等优点10 1.氟代药物已经被用于癌症、艾滋病毒、疟疾和天花感染在内的多种疾病治疗11,5-氟胞苷(5-F-Cyd)作为一种氟代核苷类药物，在临床上被广泛应用于酵母和真菌感染的治疗,其基本机制为先脱氨，转变成为5-氟尿苷，然后代谢为其它尿苷类似物，并且少量被转化为5-氟胞苷三磷酸，随后被掺人RNA合成链，进而终止RNA合成12.有研究表明，氟胞苷和氟脱氧胞苷对的人宫颈癌细胞株的生长具有较强抑制作用13.因此,我们计划对其抗肿瘤机制进行进一步的研究，以便进一步探求高效、广谱的抗肿瘤氟代化学修饰小分子药物，为癌症治疗提出新的广谱解四川大学学报（自然科学版）决方案2材料和方法2.1实验材料PANC-1 细胞、LNCaP 细胞、MCF-7 细胞、PC-3细胞购自中科院上海细胞所;细胞培养皿、96孔板、离心管购自Corning公司（中国）;DMEM培养基、PBS缓冲液、胰酶购自Hyclone公司（美国）;澳洲胎牛血清购自Thermo fisher公司（美国）;DMSO、C e llC o u n tin g K it-8 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司.2.2实验方法2.2.1小分子核苷药物的细胞活性实验取对数期生长的PANC-1细胞，胰酶消化后离心，弃上清，含有10%FBS的DMEM培养基重悬后计数，根据计数结果9 6 孔板铺板.每孔约350 0 个细胞（具体数目根据预实验确定），各实验组、阴性对照组和阳性对照组设5个复孔，1个空白组作为背景.37 培养箱过夜培养贴壁，细胞融合度为30%40%时药物处理，按浓度梯度（1nmol/L、10 nmol/L、10 0 n m o l/L、1 mol/L和 10 mol/L浓度)给药，继续培养48 h后，CCK8处理后测定吸光度.2.2.25-F-Cyd的流式细胞实验使用10 mol/L的5-F-Cyd,以及吉西他滨处理PANC-1细胞48 h，阴性对照组使用 PBS 处理.经 Annexin V-FITC细胞调亡检测试剂盒处理染色后，上机检测.2.2.3转录组测序PANC-1细胞与10 mol/L浓度的 5-F-Cyd 以及未经处理的阴性对照组(NC)共同孵育48 h后，用Trizol试剂将细胞从培养板吹打至2 mL离心管，存于一8 0 或直接送检.2.2.4DNA损伤实验用96 孔板铺板，每孔1X104个PANC-1细胞，过夜贴壁给药47 h(50 mol/L、30 mol/L、2 0 mol/L Capecit-abine，C i s p la t i n，BO，B2)使用DNA损伤试剂盒处理后，用荧光显微镜观察并拍照。2.2.5分子对接在PDB下载蛋白质结构，使用autodock tools预处理小分子结构和蛋白质结构，并设定grid,使用 autodock vina 进行虚拟对接以及用pymol分析结果.3结果与分析3.15-氟-胞苷对癌细胞增殖的作用使用经化学合成的5-氟-胞嘧啶（5-F-Cyto-056002-2第5期第5期sine，5-F-C y t）和 5-氟-胞苷（5-F-Cytidine，5-F-Cyd)在胰腺癌细胞PANC-1,乳腺癌细胞 MCF-7,前列腺癌细胞 LNcap 和 PC-3等多种癌细胞系中进行细胞增殖实验，化合物结构如图1所示.细胞活性实验使用吉西他滨（Gemcitabine,Gem)作为对照，设置五个药物浓度，经不同化合物处理48 h的细胞，使用CCK8检测细胞增殖速率（图2).实验结果表明，在多种癌细胞系中,5-F-Cyd均显示出良好的细胞增殖抑制效果,且5-F-Cyd 的活性优于广谱化疗药物吉西他滨.此外，5-F-Cyd在PANC-1、M CF-7、LNc a P细胞系中的 ICso分别为0.19 mol/L、0.8 5 mol/L和0.6 0 mol/L,展现出显著抑制肿瘤细胞增殖的活性.NH2HO.5-F-Cyt图1氟代小分子的化学结构式Fig.1 Chemical structure of fluorinated small molecule(a)1.010.80.60.40.20.0+0(c)1.00.80.60.40.20.00(ad)：G e m、5-F-Cy t、5-F-Cy d 在不同药物浓度（log)下对多种癌细胞系的增殖抑制作用。*P0.0002，*P 0.0 0 0 1Fig.2 The proliferation inhibitory activity of fluorinated small molecules in different cancer cell lines(ad):Proliferation inhibition of Gem,5-F-Cyt,and 5-F-Cyd in various cancer cell lines at different drug concentrations(log).*P0.0002，*P10MCF-710OHOH5-F-CydPANC-1*12345log.concentration/(nmol/L)LNcaP12log concentration/(nmol/L)图2 氟代小分子在不同癌细胞系中的增殖抑制活性第6 0 卷3.25-氟-胞苷处理后的转录组测序结果分析对其处理的 PANC-1 细胞进行了转录组测序,并对差异基因进行KEGG聚类分析,选取显著性最高的2 0 个基因绘制不同通路的基因表达差异图(图3).5-F-Cyd处理后,DNA复制、DNA损伤与修复、细胞周期、细胞凋亡以及与癌症相关的多条通路均有上调，显示5-F-Cyd较为明显的调节了癌症的发生与发展，且机制与影响DNA复制、造成DNA损伤和诱导细胞凋亡有关；同时，有机物的代谢以及胞质、细胞器代谢、蛋白质结合等通路发生了下调,说明5-F-Cyd影响或阻碍了细胞的正常代谢过程。表1核苷类似物药物的ICso（单位：mol/L)Tab.1 The ICso of six nucleoside analogs(unit:mol/L)细胞系PANC-1LNcaPPC-3(b)1.00.80.60.40.20.0+0(d)1.010.80.6*0.40.20.0+34Gem1010MCF-71234F5log concentration/(nmol/L)PC-301log concentration/(nmol/L)5-F-Cyd0.190.850.610*235-F-Cyt10101010Gem5-F-Cyt5-F-Cyd45056002-3第6 0 卷(a)Transciptional misreguatonin cancerTNF signaling patwaySplicoosome-RNA transpot-RibosomeProteinprocessingin endoplasmic reticulumPI3K-Akt signaling pathwayp53signaling pathwayNOD-ike receptor signaling pathwayNF-kappa Bsignaling pathwaymRNAsurvellance pathwayMismatchrepairMAPK signaling pathwayHTLV-linfectionHippo signaling pathwayHepalisBEpstoin-Barr virus infoction-DNAreplicatonCeloycle-Apoptosis图35-F-Cyd差异表达基因的聚类分析(a)上调通路；(b)下调通路Fig.3 Cluster analysis of differentially expressed genes in 5-F-Cyd(a)up-regulated pathway;(b)down-regulation pathway3.35-氟-胞苷的DNA损伤好相关性，因此磷酸化H2AX（-H 2 A X)是检测基于转录组测序中，5-F-Cyd处理后关于DNA损伤及其修复的敏感标记物.结果显示，5-F-DNA损伤和修复途径差异表达的结果，为验证其Cyd处理后的细胞产生了强烈DNA损伤荧光，说是否会造成DNA损伤，本研究用磷酸化H2AX明与转录组测序结果一致，5-F-Cyd确可引起(-H2AX)作为损伤标志物来检测DNA损伤情况DNA损伤.(DNA双链断裂).DNA双链断裂损伤（DNA3.45-氟-胞苷的三磷酸形式与polQ的虚拟对接double strand break damage,DSB)是最危险的DNA损伤实验表明，5-F-Cyd可引起DNA双DNA损伤类型之一.哺乳动物细胞中对DSB的首链断裂损伤，该损伤可通过DNA聚合酶 theta(pol0)介导的末端连接（TMEJ)进行修复.有研究表NCCis四川大学学报（自然科学版）(b)single-organismcellular process.protoin binding-organic substance metabofic process-organele partInputnumberorganelle520253035Richfactor3-logio(Pvalue)5-F-Cyd第5期singie-organism process-Input numbermetabolicprocess-17502000membrane-boundedorganelle-2250intracolularpart-25002750intracellar organole part-intracellular.organollintracellularmembrane-boundedorganelle-intracelular-cytoplasmicpart-cyroplasm-cellular process-cellular metabolic process-collpart-col-binding-明,抑制TMEJ的药物在组合治疗策略中非常DAPI有效141.(a)-H2AXRich factor1.251.201.151.101.051.00250275,-log,o(P value)(b)300325dCTPMerge1000u图45-F-Cyd造成DNA损伤NC:阴性对照组；Cis：顺铂，阳性对照组;DAPI:细胞核染色剂；YH2AX：损伤标记荧光Fig.45-F-Cyd causes DNA damageNC:negative control group;Cis:Cisplatin,positive controlgroup;DAPI,nuclear staining agent;-H2AX:damage labelingfluorescence批反应之一是组蛋白变体H2AX的Ser139残基的磷酸化,H2AX的Ser139残基的磷酸化导致染色质凝结，并在修复因子的招募中发挥重要作用，由于H2AX在Ser139位点的磷酸化与DSB具良5-F-CTPKd=1.40 10-5 mol/LKd=5.9410-7mol/L图5Cyd与5-F-Cyd的三磷酸形式分别与polo的结合情况Fig.5The binding of the triphosphate forms of Cyd and5-F-Cyd to pole,respectively为探究5-F-Cyd造成DNA损伤的分子机理，本研究用分子对接的方式探究氟修饰核苷对于polQ的亲和力影响.结果显示（图5），5-F-Cyd的三磷酸形式与pol的Kd值为5.9 410-7 mol/L,相对于其天然底物dCTP的Kd值（1.40 10-5mol/L)下降了两个数量级，即亲和力更高.此外，氟修饰还改变了核苷酸的结合位点及其与聚合酶056002-4第5期的相互作用力,相比dCTP只与pol 通过氢键连接,5-F-CTP与pol 的相互作用力更多且出现了盐键的连接（图6).这些结果表明氟修饰会大大提(a)(b)Trp863A IILys475A王绍昕，等：5-氟-胞苷抗肿瘤活性及其机制研究苷药物的潜在靶点.Ser447A第6 0 卷升核苷与pol的亲和力,改变核苷酸与pol 的相互作用力,因此pol 可能是5-F-Cyd,乃至氟代核Thr117ARLys121AGly449AGly120A图6 Cyd与5-F-Cyd的三磷酸形式与pol 的相互作用力Fig.6 Interaction between pol and triphosphate form of Cyd and 5-F-Cyd3.55-氟-胞苷可显著促进癌细胞凋亡基于5-F-Cyd在 PANC-1细胞系中显著抗癌效果，以及引起DNA损伤的结果，推测其抗癌机制之一可能是通过造成DNA损伤，进而促进肿瘤细胞凋亡,杀死肿瘤细胞.本实验以吉西他滨为阳性对照,通过流式细胞术实验探究5-F-Cyd 的促凋亡活性.结果表明（图7），经药物处理48 h后：吉西Q11051.56104PI103102101Q493.7101NC,negative control group;Gem,Gemcitabine treatment group;5-F-Cyd,5-F-Cyd treatment group4 讨 论众多研究表明，DNA损伤剂以及DNA合成抑制剂，常通过造成DNA损伤，进而触发细胞调亡来诱导肿瘤细胞死亡16,17，我们也得出了一致的结论.本研究探索了在多种癌细胞系中具有良好抗癌活性的氟代核苷类似物5-氟-胞苷.我们发现GIn805SAGIn752AAlai19AGIn749A他滨组(Gem)与文献报道一致，引起14.1%的细胞凋亡15,其中13.0%细胞处于凋亡晚期阶段，1.1%细胞处于早凋阶段；5-F-Cyd引起7 0.4%的细胞凋亡，其中6 8.8%和1.6%的细胞分别处于晚凋和早阶段.与吉西他滨相比，5-F-Cyd引起更为显著的凋亡现象.NCGemQ2Q13.721053.0710103102Q310Q41.0382.9102103NC,阴性对照组;Gem，吉西他滨处理组；5-F-Cyd，5-F-Cy d 处理组Fig.7Apoptosis analysis induced by 5-F-Cyd5-F-CydQ2Q113.010512.37104103102Q3101041.0527.2104105图7 5-F-Cyd诱导的细胞凋亡分析056002-5Q268.8Q31.62101102FITC其在多种细胞系中的活性均优于广谱化疗药物吉西他滨,此外5-氟-胞苷在胰腺癌细胞系 PANC-1中的效果较为显著.众所周知，胰腺癌作为生存率最低常见癌症，因发病位置特殊和发展速度极快，其诊断和治疗都存在极大的困难18.胰腺癌是一种侵袭性癌症,在西方国家中是恶性肿瘤相关死亡的第四大原因19.美国癌症协会估计，每年大约有103104105101102103104105第6 0 卷4.4万人死于胰腺癌2 0 1.本研究以胰腺癌细胞系(PANC-1)为模型探索核苷类药物的活性和机制，对于胰腺癌的治疗具有一定借鉴意义.为探索5-氟-胞苷的细胞生物学机制，本研究进行了转录组测序分析.结果显示，经5-F-Cyd处理后,PANC-1细胞系中与癌症发生发展、DNA复制、细胞周期、DNA损伤修复等相关的通路发生明显上调.DNA损伤实验和流式细胞术进一步验证了转录组测序结果，5-F-Cyd通过引起DNA损伤，进而促进肿瘤细胞凋亡.此外，本研究借助分子虚拟对接技术，发现5-F-Cyd的三磷酸形式与pol 0的结合位点和相互作用力与天然底物（脱氧胞嘧啶核苷三磷酸)不同,除氢键外还通过盐键与pol作用,且结合力更强.因此，5-氟-胞苷很可能以pol 0为靶点，通过阻止其修复双链断裂损伤，防止耐药的发生，强化抗肿瘤效果.pol是负责损伤修复的关键酶之一.抗肿瘤药物能引起DNA损伤，然而DNA损伤可以通过DNA损伤反应(DDR)21逆转,从而对药物产生耐药性，这个过程中存在多种DNA 聚合酶的参与2 2.因此,DNA 聚合酶是重要的药物耐药性研究靶点，值得进一步的研究与探索。综上所述，5-氟-胞苷具有显著的抑制多种肿瘤细胞增殖和促进胰腺癌细胞凋亡的效果,且很可能通过干扰pol 的修复功能,阻止耐药反应的发生，这些结果为在后续研究中将其用于胰腺癌治疗或探究核苷类药物的耐药机制提供了可能.然而，一些核苷类药物表现出的临床毒性，限制了它们的使用2 3，现多采取化学修饰将高活性分子改造为药物前体的方式2 4,降低核苷类药物的毒性.因此后续工作也将对5-F-Cyd的毒副作用进行研究，并尝试通过合理的修饰改造方法，降低毒副作用的同时，保留其高抗肿瘤活性。总之，本文对5-氟胞苷抑制癌细胞增殖活性及其作用机制进行了初步探究,其显著的抑癌活性可使其有望成为癌症治疗和新药研发改造的候选药物，值得进一步研究、探索与改造.参考文献：1Siegel R L,Miller K D,Fuchs H E,et al.Cancerstatistics J.CA Cancer J Clin,2022,72:7.2Zheng R,Zhang S,Zeng H,et al.Cancer incidenceand mortality in China,2016 J.J Natl CancerCent,2022,2:1.四川大学学报（自然科学版）3Xia C,Dong X,Li H,et al.Cancer statistics inChina and United States,2022:profiles,trends,and determinants J.Chin Med J,2022,135:584.4Govardhanagiri S,Bethi S,Nagaraju G P.Chapter8-Small molecules and pancreatic cancer trials andtroubles M/Nagaraju G P.Breaking tolerance topancreatic cancer unresponsiveness to chemothera-py:Vol.5.Cambrige:Academic Press,2019:117.5Aldred E M,Buck C,Vall K.Pharmacology（C h a p t e r 39-C h e m o t h e r a p 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