3种培养基对鸡肉产品中两类耐药菌培养的影响.pdf
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1、基金项目:上 海 市 科 技 兴 农 项 目(编 号:);国家自然科学基金青年科学基金项目(编号:)作者简介:黄柳娟,女,上海市农业科学院研究实习员,硕士。通信作者:邵毅(),女,上海市农业科学院副研究员,博士。:收稿日期:改回日期:犇 犗 犐:犼 狊 狆 犼 狓 文章编号 ()种培养基对鸡肉产品中两类耐药菌培养的影响 黄柳娟犎犝犃犖犌犔 犻 狌 犼 狌 犪 狀樊彦莉犉 犃犖犢 犪 狀 犾 犻钟海犣犎犗犖犌 犎 犪 犻蒋静犑 犐 犃犖犌犑 犻 狀 犵邵毅犛犎犃 犗犢 犻(上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海 ;上海海关动植物与食品检验检疫技术中心,上海 ;上海海关,上海 )(犐
2、 狀 狊 狋 犻 狋 狌 狋 犲 犳 狅 狉犃 犵 狉 犻 犳 狅 狅 犱犛 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 狊犪 狀 犱犜 犲 狊 狋 犻 狀 犵犜 犲 犮 犺 狀 狅 犾 狅 犵 狔,犛 犺 犪 狀 犵 犺 犪 犻犃 犮 犪 犱 犲 犿 狔狅 犳犃 犵 狉 犻 犮 狌 犾 狋 狌 狉 犪 犾犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲 狊,犛 犺 犪 狀 犵 犺 犪 犻 ,犆 犺 犻 狀 犪;犜 犲 犮 犺 狀 犻 犮 犪 犾犆 犲 狀 狋 犲 狉 犳 狅 狉犃 狀 犻 犿 犪 犾,犘 犾 犪 狀 狋犪 狀 犱犉 狅 狅 犱犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狅
3、 犳犛 犺 犪 狀 犵 犺 犪 犻犆 狌 狊 狋 狅 犿 狊,犛 犺 犪 狀 犵 犺 犪 犻 ,犆 犺 犻 狀 犪;犛 犺 犪 狀 犵 犺 犪 犻犆 狌 狊 狋 狅 犿 狊,犛 犺 犪 狀 犵 犺 犪 犻 ,犆 犺 犻 狀 犪)摘要:目的:评估不同培养基对鸡肉产品表面四环素耐药()菌和磺胺耐药()菌菌群的培养效果差异。方法:基于高通量测序技术,分析分别在脑心浸液肉汤()、胰蛋白胨大豆琼脂()和平板计数琼脂()种培养基上培养获得的冷鲜鸡和鸡肉熟食表面菌和菌的菌群结构及丰度。结果:在冷鲜鸡表面鉴定到的 个属的耐药细菌中,仅在 、和 培养基上获得培养的特有菌属各有,个,特有菌属各有,个;在鸡肉熟食样
4、品表面鉴定到的 个属的耐药菌中,种培养基上的特有菌属分别为,个,特有菌属分别为,个。耐药菌属丰度差异的 分析结果表明,和 对耐药菌群的结构影响具有较高的相 似 性,冷 鲜 鸡 表 面种菌(气 单 胞 菌 属犃 犲 狉 狅 犿 狅 狀 犪 狊 、水栖菌属犈 狀 犺 狔 犱 狉 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 、乳杆菌属犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 和 泛 菌 属犘 犪 狀 狋 狅 犲 犪 )和种菌(肠球 菌 属犈 狀 狋 犲 狉 狅 犮 狅 犮 犮 狌 狊 和 乳 杆 菌 属犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 )在 培养基上获得培养的稳定性及丰度均较高。结论:不
5、同培养基获得耐药菌的种类及丰度存在差异,应汇总多种培养基培养所得菌群的测序信息,才能完整描述鸡肉样品表面耐药菌的组成。关键词:鸡肉;脑心浸液肉汤培养基();胰蛋白胨大豆琼脂培养基();平板计数琼脂培养基();四环素耐药菌;磺胺耐药菌;高通量测序犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋:犗 犫 犼 犲 犮 狋 犻 狏 犲:()犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊:,()()(),()()犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊:,犃 犲 狉 狅 犿 狅 狀 犪 狊 ,犈 狀 犺 狔 犱 狉 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 ,犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犘 犪 狀 狋 狅 狅 犲 犪 ,犈 狀 狋 犲 狉 狅
6、犮 狅 犮 犮 狌 狊 犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犆 狅 狀 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀:,犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊:;();();();();();第 卷第期 总第 期 年月 养殖业抗生素的滥用导致农业生产成为抗生素耐药菌(,)的一大来源,农业源 菌可能通过食物链传播至人类。水平基因迁移(,)是耐药基因在各类细菌中扩散的重要方式,但相较于致病菌,数量庞大、遗传背景丰富、可能更频繁地参与 的非致病菌的耐药性尚未受到系统监测和研究。其中标准化、批量化培养、分离 菌技术的缺乏,是制约非致病菌耐药性研究的瓶颈问题之一。活细菌的分离检测对于细菌种类的进一步表征至关重要。
7、培养基类型和成分浓度会影响可培养细菌群落构成和单类细菌的生长速率,以及对抗生素的耐受性。针对未知耐药细菌群落的初步筛查或耐药基因的迁移研究,科研人员使用脑心浸液肉汤()、麦康凯琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂()、平板计数琼脂()等培养基,但这些培养基对不同基质中的不同 菌的培养效果并未得到评估。培养基营养物质的丰富度对可培养细菌的种类和数量的影响尚无定论,鉴于 、和 培养基对细菌培养的普适性或在标准化操作中的广泛应用 ,研究拟以这种培养基为例,基于高通量测序技术,分析在不同培养基上培养获得的冷鲜鸡和鸡肉熟食表面四环素 耐 药(,)菌 和 磺 胺 耐 药(,)菌的菌群结构和菌属丰度,为评估培养基对不同基
8、质上不同 菌的培养效果提供依据。材料与方法材料与仪器材料与试剂份冷鲜鸡产品(整鸡、鸡胸肉、鸡腿肉和鸡翅,编号分别为、和)和份散装鸡肉熟食制品(白斩鸡、盐水鸡和烤鸡,编号分别为、和):无菌袋包装后置于冰袋中,内送回实验室,市售;培 养 基、培 养 基 及 培 养 基:英 国 公司;真 菌 抑 制 剂 放 线 菌 酮():分 析 纯,美 国 公司;四环素()、磺胺甲恶唑()、甲氧苄啶():分析纯,美国 公司;生理盐水:广东环凯微生物科技有限公司;医用酒精:国药集团化学试剂有限公司;细菌基因组提取试剂盒:德国 公司;聚合酶链式反应()试剂盒、琼脂糖电泳试剂盒:北京全式金生物技术有限公司;产 物 电
9、泳 凝 胶 回 收 试 剂 盒:美 国 公司;引物:生工生物工程(上海)股份有限公司。主要仪器设备均质机:型,法国 公司;水平核酸电泳系统:型,美国 公司;凝胶成像系统:型,美国 公司;超 微 量 分 光 光 度 计:型,美 国 公司;高压灭菌锅:型,日本公司。方法菌和菌的培养根据 和 等 的方法从鸡肉样品表面初步培养出对四环素或磺胺甲恶唑耐药的细菌。无菌条件下将样品表面(深度不超过)的组织剪碎,混匀,准确称量 于无菌袋中,加入 无菌生理盐水,用均质机拍打 制成均质液。吸取 均质液分别均匀涂布于种培养基(、)平皿上,每种培养基平皿中 含 有 和 (分 别 记 为 组、组和 组),或 、和 (分
10、 别 记 为 组、组和 组),或仅含有 (分别记为 组、组和 组),分别对样品中的可培养菌、可培养菌和可培养总菌进行培养。每个处理重复次。所有平皿于()下倒置培养,将同组的个平皿中的菌体全部刮取并混合,提取细菌总脱氧核糖核酸()后进行菌群多样性分析。细菌总 的提取用 生理盐水重悬刮取培养皿上的菌体,充分混匀,取 菌悬液,用细菌基因组提取试剂盒提取细菌总。经琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计测定后,对 基因的 区 域 进 行 扩 增,上 游 引 物 为 :,下 游 引 物 为 :。用 琼 脂 糖 凝 胶 电泳检测 扩增产物质量后,委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序。高通量测序基于
11、测序平台进行测序,使用 ()对 进行低质量部分剪切,得到最终的有效数据()。利用 软件()对所有样品的全部 进行聚类,默认以 的一致()将序列聚类成为 ,对 序列进行物种注释。对各样品的数据进 ,黄柳娟等:种培养基对鸡肉产品中两类耐药菌培养的影响行均一化处理,以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理,最终确定各物种的相对丰度。基于均一化处理后的数据,利用多样性分析中的主坐标分析()比较样本之间的差异,并用 方法对组间的物种丰度数据进行假设检验得到犘值,根据犘值筛选具有显著性差异的物种。结果与分析两类可培养 菌的菌群结构及可培养总菌的差异由图、图可知,不论使用哪种培养基,每个样品中的两类 菌与总
12、菌相比,排名前十的优势菌属在种类和丰度上均有差异,甚至在冷鲜鸡和鸡肉熟食样品中分别有(样品,用 培养)(样品,用 培养)、(样品,用 培养)(样品,用 培养)个属的耐药细菌在对应的可培养总菌(从不含抗生素的培养基上培养获得)中并未得到鉴定,说明冷鲜鸡和鸡肉熟食表面各类耐药细菌菌群的组成各不相同。因此,有必要研究不同培养基对某类 菌菌群培养效果的影响。种培养基对两类可培养 菌组分的影响由表、表可知,冷鲜鸡表面共鉴定出 个属的菌和 个属的菌,多于前期研究 及单一 培养基中的。其中 个种属的菌和 个种属的菌在种培养基上被鉴定出,而仅在 、和 培养基上鉴定出的特有菌属各有,个,菌属为,个。在鸡肉熟食样
13、品表 面 共 鉴 定 出 个属 的菌和 个属的菌,其中种培养基的共有菌属分别为,个,特有菌属分别为,个,菌属分别为,个。微生物菌群中某个菌株或某类菌属是否能获得培图种培养基上的可培养总菌()、菌和菌的优势菌属及丰度排名 ,图种培养基上的可培养总菌()、菌和菌的种属数维恩图 ,基础研究 总第 期 年月养,除受培养基质能提供的营养支持及抗生素抑制外,还受到周边菌群的协同促进或竞争抑制。鸡肉熟食表面只在 培 养 基 上 得 到 培 养 的菌 为 环 丝 菌 属(犅 狉 狅 犮 犺 狅 狋 犺 狉 犻 狓 ),只在 培养基上得到培养的菌为乳杆菌属(犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 )
14、,只在 培养基上得到培养的菌为拟杆菌属(犅 犪 犮 狋 犲 狉 狅 犻 犱 犲 狊 )和肉杆菌属(犆 犪 狉 狀 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 狌 犿 ),但这些菌属在冷鲜鸡样品中的种培养基上均能得到培养;而冷鲜鸡表面只在 培养基上得到培养的菌犆 犲 狋 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 狌 犿 在鸡肉熟食样品中 的种 培 养 基 上 均 能 得 到 培 养,慢 生 根 瘤 菌 属(犅 狉 犪 犱 狔 狉 犺 犻 狕 狅 犫 犻 狌 犿 )在鸡肉熟食样品中用 培养基也能得到培养。因此,培养基对表、表中涉及的菌表种培养基特异性培养的菌 门 冷鲜鸡鸡肉熟食 冷鲜鸡鸡肉熟食 冷鲜鸡鸡肉熟食放线菌门(
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