紫连膏对大鼠银屑病治疗机制研究.pdf
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1、云南民族大学学报(自然科学版),():收稿日期:基金项目:国家自然科学基金();云南省重大科技专项项目();云南省千人计划(青年人才项目);云南省高校重点实验室建设计划作者简介:李元策(),男,硕士研究生主要研究方向为药理学通信作者:尹俊林(),男,博士,副教授 主要研究方向为天然药物化学和药理学叶建州(),男,硕士,教授,主任医师 主要研究方向为中医与中西医结合皮肤病基础及临床紫连膏对大鼠银屑病治疗机制研究李元策,孙玉梅,王艳雯,杨雪松,尹俊林,叶建州(云南民族大学 民族医药学院 民族药资源化学国家民委 教育部重点实验室,云南 昆明 ;云南中医药大学第一附属医院 皮肤病专科医院,云南 昆明
2、)摘要:鉴定了紫连膏的主要化学成分,并研究紫连膏对咪喹莫特银屑病大鼠治疗作用 采用 高效液相色谱法分析鉴定紫连膏甲醇提取物主要成分;法检测紫连膏甲醇提取物对永生化角质形成细胞 的增殖影响;双染法检测紫连膏甲醇提取物对 细胞凋亡的作用;建立 大鼠银屑病模型,研究紫连膏对大鼠银屑病病理及相关细胞因子的影响 研究发现紫连膏含有乙酰氧基异戊酰阿卡宁、龙胆苦苷、胡黄连苷;紫连膏甲醇提取物对 细胞有一定增殖抑制作用 和 的紫连膏甲醇提取物对 细胞有极显著的促凋亡作用();经过紫连膏治疗后,紫连膏高剂量组显著减少了银屑病大鼠皮肤的鳞屑、红斑、厚度();造模皮肤组织中 的 表达量上升,的 表达量下降();降低
3、了银屑病大鼠血清中 的含量,增加了皮肤中 的含量()研究表明紫连膏中含有乙酰氧基异戊酰阿卡宁、龙胆苦苷、胡黄连苷;紫连膏可以通过诱导角质细胞凋亡,调节 、来治疗银屑病关键词:紫连膏;银屑病;卡泊三醇中图分类号:文献标志码:文章编号:()银屑病是一种与自身免疫相关,由多种因素介导的皮肤炎症,其发病与遗传、免疫、内分泌等多因素相关 ,其临床症状表现为棘层增厚、白色云母状鳞屑、红斑 对银屑病的发病机制的研究发现其病症主要为角质细胞过度增殖及分化异常 ,后来逐渐发现银屑病与自身免疫的相关 ,近些年的研究发现银屑病与 细胞的 轴相关 ,但至今其发病机制尚未被完全研究清楚 目前与银屑病相关的免疫细胞包括角
4、质形成细胞()、树突状细胞()、细胞三大类 作为人体最外层的人体免疫屏障,不仅具有阻止外来病原进入体内的作用,同时也是将外来刺激信号呈递到体内的重要受体 银屑病患者的 细胞过度增殖及分化异常,并产生白介素 ()、白介素 (),这 种细胞因子会刺激下游的 细胞 细胞是人体免疫中重要的抗原提呈细胞(),能够影响 细胞的活化及慢性炎症的发生发展,在银屑病中 细胞与 细胞共同起到关键作用 受到刺激后的 细胞产生白介素()、白介素 (),这两种细胞因子又进一步刺激 细胞,诱导辅助 细胞分化为 ,可以产生白介素 ()、白介素 ()、肿瘤坏死因子 (),这些炎症因子可以反过来作用于 细胞,形成正反馈调节,加
5、重银屑病的症状 在药物治疗方面,传统临床上的常用的治疗银屑病的药物有维生素 类似物卡泊三醇、糖皮质激素、阿维 等 另外,随着对银屑病治病机制的研究,针对新的靶点的药物也不断出现,如本维莫德、抗人白介素 单克隆抗体乳膏等银屑病在中医文献中被称为“白疙”,隋 诸病源候论 曰:“枯索,痒,搔之白屑出是也 ,皆是风湿邪气客于腠理,复值寒湿与血气相搏所发病 若其风毒偏胜盛,湿气少,故风沉入深,则无汁,为干癣也”中医认为银屑病是由于血热引起的,因此治疗银屑病的中药主要功效以祛风止痒、益气养阴为主 紫连膏是云南省中医医院的一款院内制剂,由紫草、虎杖、当归、地黄、黄连、蒲公英、龙胆、黄芩、黄柏、紫花地丁、冰片
6、等制成的外用软膏 具有清热解毒祛腐生肌的功效,临床上用于治疗烫伤、烧伤、银屑病等紫连膏主要药材之一的紫草中所含的紫草素,已经有报导证明能够降低 相关的细胞因子,对银屑病有一定治疗作用 除此之外,地黄、当归、黄芩等也被报道含有多种具有抗炎作用的化合物 动物实验以及临床上已经证明紫连膏对银屑病具有一定的治疗作用 前期研究发现紫连膏可以治疗小鼠银屑病 ,文中进一步研究紫连膏治疗银屑病的机制,分析紫连膏所含化学成分,并验证紫连膏对于银屑病在种间存在广谱治疗作用 此研究主要针对中药推广过程中所需的实验研究,为紫连膏进一步推广提供基础 材料和方法 材料梓醇、乙酰氧基异戊酰阿卡宁、胡黄连苷、虎杖苷、龙胆苦苷
7、、黄芩苷、盐酸小檗碱、表儿茶素标准品(,中国);人源角质形成细胞 (中科院昆明细胞库,中国);紫连膏(云南省中医医院,中国)实验动物体重 ,雌性大鼠,周龄为 周(北京斯贝福有限公司,中国)试剂及仪器高效液相色谱(,美国);色谱柱(,美国);细胞凋亡检测试剂盒(,中国);凡士林乳膏(山东德新康医疗科技有限公司,中国);卡泊三醇乳膏(利奥制药有限公司,爱尔兰);脱毛膏(广州梦希蓝化妆品有限公司);咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司,中国);、试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司,中国);酶标仪(,美国);三目倒置显微镜(,德国);流式细胞仪(,美国)实验方法 紫连膏化学成分提取及鉴定 成分提取
8、取 紫连膏成品,加入到 甲醇溶液中,热回流 ,所得的产物置于 过夜,取上清,微孔滤膜过滤,减压干燥 成分鉴定取 紫连膏提取物溶于 甲醇中,制成 的溶液,超声 (,),微孔滤膜过滤 取梓醇、乙酰氧基异戊酰阿卡宁、胡黄连苷、虎杖苷、龙胆苦苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、表儿茶素 分别制成 、和 的标准品溶液 液相色谱条件:反向色谱柱(,),甲醇 水梯度洗脱:();甲醇洗脱 ,流速 进样量 ,柱温 ,检测波长梓醇 ,其他化合物 细胞复苏及传代 细胞复苏取待复苏细胞于 水浴锅中快速解冻,加入 完全培养基重悬细胞,、离心,去上清,重悬细胞,完全培养基培养 细胞传代 细胞传代,吸取旧的培养基,清洗 次;胰酶消化细
9、胞后,加入 完全培养基终止消化,重悬细胞,取 重悬细胞液加入 完全培养基中继续培养第 期李元策,孙玉梅,王艳雯,等:紫连膏对大鼠银屑病治疗机制研究 法检测细胞增殖作用收集指数生长期细胞,孔板中每孔加入 个细胞 根据预实验结果取存活率在 的个浓度(、)的紫连膏提取物及 作用下培养 每孔加入 三氯乙酸固定 ,蒸馏水清洗 次;再每孔加入 溶液,室温染色 ,冰乙酸洗板次,再每孔加入 裂解液,震荡 ,酶标仪检测 处吸光度 细胞凋亡检测收集指数生长期细胞,孔板每孔加入 个细胞,根据预实验结果取 、个紫连膏提取物浓度及 作用下培养 培养结束后将细胞收集到 管中 ,离心 ,清洗 次;加入 重悬细胞后,加入 和
10、 室温避光保存 ;再加入 ,流式细胞仪检测 ,染料吸光度 动物模型建立将 只 ,周,雌性 大鼠分为空白对照组 只,模型组 只 在实验鼠背部用脱毛膏脱毛形成 的银屑病模型部位,模型组每日每只均匀涂抹 咪喹莫特乳膏于背部银屑病造模区域,空白对照组每天涂抹等量凡士林;连续造模 ,第 天观察是否有鳞屑、红斑及角质增厚等银屑病病症 大鼠银屑病模型动物的治疗大鼠银屑病动物模型造模成功后,将 只大鼠随机分为紫连膏高剂量组()、紫连膏中剂量组()、紫连膏低剂量组()、卡泊三醇组()、咪喹莫特组;给药剂量参照紫连膏临床给药量(),治疗期间每天继续涂抹 咪喹莫特维持银屑病症状;空白对照组每天共涂抹 凡士林 评分在
11、治疗阶段每天对小鼠银屑病表观病症进行观察并进行打分,打分标准依据 评分标准 该标准以鳞屑、红斑及角质增厚为观测对象,从无到全覆盖分为 分(表 )表 银屑病 评分标准分数红斑无可见红斑呈淡红色红色深红色极深红色鳞屑无可见鳞屑部分皮损表面上覆鳞屑,多 数 为 细 微鳞屑大多数皮损表面完全或不全覆有鳞屑,鳞屑呈片状几乎全部皮损表面覆有较厚鳞屑全部皮损表面均覆有厚鳞屑,鳞屑堆基成层增厚与正常皮肤表面齐平皮损肥厚,明显隆起皮损高度增厚,隆起极为明显 银屑病大鼠组织病理学观察将治疗过后各组大鼠的背部模型区域的皮肤组织取下,福尔马林中浸泡 ,自来水冲洗 清洗残留的福尔马林;然后依次浸泡到 、乙醇、二甲苯每种
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