左西孟旦对脓毒症心肌损伤小鼠的保护作用及机制研究.pdf
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1、论 著文章编号(23)5-0481-06左西孟旦对脓毒症心肌损伤小鼠的保护作用及机制研究柴鹏程1,韩海波1,胡振杰2,陈玉红2(1.河北医科大学临床学院,石家庄050020;2.河北医科大学第四医院重症医学科,石家庄050011)摘要 目的:探讨左西孟旦(Levo)对脓毒症心肌损伤(SMI)小鼠心脏功能的保护作用及其作用机制。方法:清洁级雄性C57小鼠,体重2530 g,适应性饲养1周,腹腔注射脂多糖(LPS)复制SMI疾病模型。将小鼠随机分为正常对照(Control)组、SMI组、SMI+Levo组,共3组(n=6)。心脏超声观察小鼠左室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(LVFS)及心输出
2、量(CO)变化,并留取小鼠静脉血和心脏组织,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆肌钙蛋白(cTnI)、肌酸激酶(CK)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-1(IL-1)水平,苏木精-伊红染色(HE)观察心脏形态学改变,电镜观察心肌组织线粒体形态及自噬小体。结果:与Control组相比,SMI组的LVEF、LVFS及CO明显下降(分别为65.968.16vs.35.784.87,35.876.05vs.16.802.58,18.192.84vs.9.341.23,均P0.01),血浆cTnI(ng/mL)、CK(U/L)、TNF-(g/L)、IL-1(g/L)水平明显升高(分别为1.250
3、.36 vs.6.990.39,866.93378.51 vs.5 427.22875.23,58.3310.98 vs.658.5091.87,32.833.43 vs.114.835.98,均P0.01)。与SMI组比较,SMI+Levo组的LVEF、LVFS及CO均明显升高(分别为35.784.87 vs.45.882.63,16.802.58 vs.24.013.4,9.34 1.23 vs.14.803.41,均P0.01),血浆cTnI、CK、TNF-、IL-1水平明显下降(分别为6.990.39 vs.6.240.46,5 427.22875.23 vs.3587.67460.9
4、0,658.5091.87 vs.431.0018.17,114.83 5.98 vs.74.7026.13,均P0.01)。光镜下Control组心肌形态学结构正常;SMI组可见心肌纤维变性,炎细胞浸润等改变;SMI+Levo组上述改变可见明显好转。电镜下可见Control组心肌细胞形态正常,心肌纤维排列整齐,线粒体形态规整;SMI组心肌细胞可出现坏死改变,心肌纤维排列不整齐,线粒体排列紊乱,水肿,自噬小体增多;SMI+Levo组上述病理改变有明显好转。结论:Levo对SMI小鼠具有心脏保护作用,其机制可能是通过减轻炎症反应、改善线粒体功能发挥作用。关键词脓毒症;脓毒症心肌损伤;左西孟旦;心
5、脏;线粒体中图分类号R961文献标志码Protective effect and mechanism of Levosimendan on sepsis induced myocardial injury in miceCHAI Peng-cheng1,HAN Hai-bo1,HU Zhen-jie2,CHEN Yu-hong2(1.Clinical College,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050020,China;2.Department of critical care medicine,The FourthHospital,Hebei
6、Medical University,Shijiazhuang 050011,China)AbstractObjective:To investigate the protective effect of Levosimendan(Levo)on cardiac function in septic myocardial injury(SMI)mice and its mechanism.Methods:Clean grade male C57 mice,weighing 25-30 g,were fed adaptively for one week,and intraperitoneali
7、njection of lipopolysaccharide(LPS)was used to make sepsis myocardial injury disease model.The mice were randomly divided into threegroups(n=6):control group,SMI group,and SMI+Levo group.The changes of left ventricular ejection fractions(LVEF),left ventricularfractional shortening(LVFS)and cardiac o
8、utput(CO)in mice were observed by echocardiography,and venous blood and cardiac tissuewere collected.Plasma cardiac troponin I(cTnI),creatine kinase(CK)and tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin-1(IL-1)were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Hematoxylin eosin staining(HE)was used
9、 to observe the morphologicalchanges of the heart,and electron microscopy was used to observe the morphology of myocardial mitochondria and autophagosomes.Results:Compared with the control group,LVEF,LVFS and CO in SMI group decreased significantly(65.968.16 vs.35.784.87,35.876.05 vs.16.802.58,18.19
10、2.84 vs.9.341.23,respectively,all P0.01).Plasma cTnI(ng/mL),CK(U/L),TNF-(g/L)、IL-1(g/L)level increased significantly(1.250.36 vs.6.990.39,866.93378.51 vs.5 427.22875.23,58.3310.98 vs.658.5091.87,32.833.43 vs.114.835.98,respectively,all P0.01).Compared with SMI group,LVEF,LVFS and CO in SMI+Levo grou
11、p increased significantly(35.784.87 vs.45.882.63,16.802.58 vs.24.013.4,9.341.23 vs.14.803.41,respectively,all P0.01),plasma level of cTnI,CK,TNF-,IL-1 were significantly decreased(6.990.39 vs.6.240.46,5 427.22875.23 vs.3 587.67460.90,658.5091.87 vs.431.0018.17,114.835.98 vs.74.7026.13,respectively,a
12、ll P0.01).Myocardial morphology was normal in control group under light microscope.Myocardial fibrosis and inflammatory cell infiltration were observed in SMI group.In SMI+Levo group,the above changes were obviously基金项目 河北省高等学校大学生创新创业训练项目(S 2 0 2 1 1 3 4 1 5 0 1 3)作者简介 柴鹏程(2 0 0 1-),男,学士在读,研究方向:脓毒症;
13、韩海波(1 9 9 9-),男,学士在读,研究方向:脓毒症;通信作者:陈玉红,E-m a il:2 7 2 4 0 9 9 9 0 q q.c o m。天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University第29卷5期23年9月 29熏 5Sep.23481improved.Under electron microscope,the morphology of myocardial cells in control group was normal,the myocardial fibers were arrangedorderly,and the morp
14、hology of mitochondria was regular.Myocardial cells in SMI group showed necrosis,irregular arrangement of myocardial fibers,disordered arrangement of mitochondria,edema,and increased autophagosomes.In SMI+Levo group,the above pathologicalchanges were obviously improved.Conclusion:Levosimendan has a
15、cardioprotective effect on SMI mice,and its mechanism may bethrough reducing inflammatory reaction and improving mitochondrial function.Key wordssepsis;SMI;Levosimendan;heart;mitochondria脓毒症是指机体对 感染反应失调引起的器官功能障碍的一种疾病,常可危及生命,是重症医学常见的急危重症,病死率高达30%1。脓毒症心肌损伤(septic myocardial injury,SMI)是导致脓毒症患者死亡的主要原因之
16、一。根据研究调查结果显示,脓毒症患者会出现不同程度的心肌损伤,其中40%50%的患者出现心肌抑制,7%左右的患者出现心力衰竭,未合并心脏损伤患者病死率约为20%,合并心脏损伤患者死亡率大于70%2。SMI的发病机制目前并未完全阐明,大量动物实验研究证实,炎症、氧化应激以及心肌细胞线粒体能量代谢障碍是SMI进而影响心肌功能的主要原因3。左西孟旦(levosimendan,Levo)是一种钙离子增敏剂,具有良好的正性肌力和扩血管功能。此外,Levo还显示出其他重要的非正性肌力作用,包括抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。临床研究证实,Levo可通过改善心力衰竭患者线粒体氧化平衡,达到心脏保护作用4。由此笔者
17、提出假设,Levo可能会通过影响SMI小鼠的心肌细胞线粒体功能进而发挥心脏保护作用,本实验进一步研究Levo对SMI的作用机制,以期对 其临床应用提供一定的理论依据。1材料与方法1.1动物分组及给药清洁级雄性C57小鼠,体重2530g,由北京维通利华公司提供。适应性饲养1周,随机分为Control组、SMI组、SMI+Levo组,每组6只。自由进食和饮水1周。SMI组 腹腔注射脂多糖(LPS)(10 mg/kg),SMI+Levo组 在给予LPS后3 h腹腔注射Levo(24 g/kg),SMI组在给予LPS后3 h腹腔注射同等剂量生理盐水,Control组 在0、3 h腹腔注射同等剂量生理盐
18、水。腹腔注射LPS后,SMI组 与SMI+Levo组 小鼠均出现毛发竖立、精神萎靡等脓毒症表现,而Control组 无上述表现。所有实验均在河北医科大学第四医院动物实验中心完成,经过河北医科大学第四医院实验动物伦理委员会授予的项目许可(2020002)。1.2心脏超声测定6 h测定小鼠心脏功能,腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,胸前区脱毛,使用VEVO2100超声设备(VisualSonics公司)获取经胸二维M型超声心动图,反复测量3次,选取3个连续心动周期,测量计算得出左室射血分数(left ventricular ejection fractions,LVEF)、缩短分数
19、(left ventricular fractional shortening,LVFS)及心输出量(cardiac output,CO)。1.3血及组织标本的采集与处理超声测量完毕后摘眼球取血处死小鼠,留取的血标本中加入抑肽酶20 L、10%EDTA-Na 15 L,4 3 000 r/min,离心15 min,取上清液-80保存;快速留取小鼠心脏,生理盐水冲洗干净后放入4%甲醛固定液中保存,待HE染色后于光镜下观察心肌组织形态学改变。留取部分左心室放入4%戊二醛固定,待电镜观察。1.4检查指标及方法1.4.1血浆肌钙蛋白(cTnI)、肌酸激酶(creatinekinase,CK)、肿瘤坏死
20、因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)水平测定酶联免疫吸附法(enzyme linked immunesorbent assay,ELISA)测定血浆中cTn、CK、TNF-、IL-1水平,药盒购自北京欣博盛生物科技有限公司,具体操作步骤按照 说明书进行。1.4.2苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)观察心脏组 织形态学改变心肌组 织在4%多聚甲醛中室温固定48 h,石蜡包埋,切片,HE染色,在光学显微镜下观察(DM3000 LED,Wetzlar,德国)。根据Kishi
21、moto方法5对 每组 小鼠心肌病理变化进行评分,即每张切片选取5个高倍视野,从炎性细胞浸润和心肌变性坏死两方面观察病变情况,计算每个视野中炎性浸润和坏死区域面积与整个视野的面积之比,无病变计0分,25%计1分,25%50%计2分,50%75%计3分,75%计4分。1.4.3透射电子显微镜观察心脏组织线粒体改变取出经4%戊二醛固定的心脏组 织,经脱水、包埋、切片及染色后,在电镜下(HT7800/HT7700,东京,日本)观察,采集不同倍数下心肌组 织中线粒体形态及自噬小体图像并留存。1.5统计学处理采用SPSS21.0统计软件包,数据均以表示,多个样本均数间比较采用单因素方差(ANOVA)分析
22、,P0.05为差异有统计学意义。第29卷天津医科大学学报4822结果2.1小鼠心脏功能指标变化与Control组 相比,SMI组 小鼠心脏功能指标LVEF、LVFS及CO均明显降低(分别为65.968.16 vs.35.784.87,35.876.05vs.16.802.58,18.192.84 vs.9.341.23,均P0.05);与SMI组 相比,SMI+Levo组LVEF、LVFS及CO差异有统计学意义,三者均明显升高(分别为35.784.87vs.45.882.63,16.802.58 vs.24.013.4,9.34 1.23vs.14.803.41,均P0.05),见图1。2.2
23、小鼠心肌损伤指标变化与Control组 相比,SMI组 小鼠心肌损伤指标cTnI、CK均明显升高(1.250.36 vs.6.990.39,866.93378.51 vs.5 427.22875.23,均P0.05);与SMI组 相比,SMI+Levo组 小鼠cTnI、CK均明显降低(分别为6.990.39 vs.6.240.46,5 427.22875.23 vs.3 587.67460.90,均P0.05),见图2。2.3小鼠血浆炎症因子水平变化与Control组相比,SMI组 小鼠的血浆TNF-(g/L)、IL-1(g/L)水平均显著升高(58.3310.98 vs.658.5091.8
24、7,32.833.43 vs.114.835.98,均P0.01);与SMI组 比较,SMI+Levo组 小鼠TNF-、IL-1水平均明显降低(658.50 91.87 vs.431.00 18.17,114.83 5.98 vs.74.7026.13,均P0.01),见图3。注:LVEF:左室射血分数;LVFS:左室缩短分数;CO:心输出量;Control:空白对 照 组;SMI:脓毒症心肌损伤组;SMI+Levo:左西孟旦治疗组图1入组后6 h各组小鼠LVEF、LVFS、CO水平变化Fig 1Changes in LVEF,LVFS,and CO levels of mice in eac
25、h group 6 hours after grouping注:cTnI:血浆肌钙蛋白;血浆CK:血浆肌酸激酶;Control:空白对 照 组;SMI:脓毒症心肌损伤组;SMI+Levo:左西孟旦治疗组图2入组后6 h各组小鼠血浆cTnI、CK水平变化Fig 2Changes in plasma cTnI and CK levels of mice in each group6 hours after grouping6040200LVEF(100%)Control 组SMI 组SMI+Levo 组Control 组SMI 组SMI+Levo 组Control 组SMI 组SMI+Levo 组
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