脂肪间充质干细胞来源外泌体对施万细胞增殖功能及早期神经再生特征影响的研究.pdf
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1、脂肪间充质干细胞来源外泌体对施万细胞增殖功能及早期神经再生特征影响的研究任致奇1,2,尚爱加1,2,杨博尧1,3,柏钧1,2,贾志博1,3,刘修志1,3,王玉1,31解放军医学院,北京100853;2解放军总医院第一医学中心神经外科,北京100853;3解放军总医院第四医学中心骨科医学研究所,北京100853摘要:背景施万细胞是神经系统的重要构成部分,为促进轴突再生和诱导靶神经再生提供必要的信号和空间线索。脂肪间充质干细胞来源广泛,在再生医学方向效果明确,外泌体作为神经系统细胞间的重要信息媒介,在调节再生方面发挥着重要作用。目的探索脂肪间充质干细胞来源外泌体(adipose-derivedst
2、emcells-derivedexosomes,ADSCs-exos)对施万细胞增殖功能及早期神经再生特征的影响。方法提取 ADSCs-exos 进行鉴定;利用显微镜和流式细胞学对 ADSCs 鉴定,通过超速离心法提取 ADSCs 来源外泌体并通过透射电镜拍摄图片;将 ADSCs-exos 与大鼠施万细胞进行直接共培养,观察ADSCs-exos 对施万细胞增殖的影响;取雌性 SD 大鼠 8 只,Matrigel 基质胶搭载 ADSCs-exos 注入商用硅胶管构建神经移植物为外泌体组,Matrigel 搭载 PBS 注入商用硅胶管为空导管组(Hollow),每组 4 只。构建坐骨神经 1cm
3、缺损模型,将神经移植物缝合于近端和远端神经残端之间,缝合伤口后放回笼中安置。3 周取出神经移植物评价轴突再生情况。结果成功提取 ADSCs,能够表达间充质干细胞表面标记蛋白 CD73、CD90、CD105。成功提取 ADSCs-exos,能在透射电镜下观察到磷脂双分子层结构。在 ADSCs-exos 和施万细胞共培养体系中,比较 24h 和 48h 施万细胞增殖情况,施万细胞增殖与 ADSCs-exos 浓度呈剂量依赖性。动物实验结果表明,外泌体组 3 周时轴突生长优于 Hollow 组(P0.05)。结论ADSCs-exos 可以促进施万细胞增殖,负载 ADSCs-exo 神经移植物的轴突生
4、长长度在 3 周时即具有优势。关键词:外周神经损伤;脂肪来源干细胞;外泌体;修复;施万细胞中图分类号:R651文献标志码:A文章编号:2095-5227(2023)06-0694-06DOI:10.3969/j.issn.2095-5227.2023.06.019引用本文:任致奇,尚爱加,杨博尧,等.脂肪间充质干细胞来源外泌体对施万细胞增殖功能及早期神经再生特征影响的研究J.解放军医学院学报,2023,44(6):694-699.Effects of adipose-derived mesenchymal stem cell exosomes on Schwann cell prolifera
5、tion andearly nerve regenerationRENZhiqi1,2,SHANGAijia1,2,YANGBoyao1,3,BOJun1,2,JIAZhibo1,3,LIUXiuzhi1,3,WANGYu1,31ChinesePLAMedicalSchool,Beijing100853,China;2DepartmentofNeurosurgery,theFirstMedicalCenter,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China;3InstituteofOrthopedicMedicine,theFourthMedical
6、Center,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,ChinaCorrespondingauthor:SHANGAijia.Email:Abstract:BackgroundSchwanncellsareimportantcomponentsofthenervoussystem,providingnecessarysignalsandspatialcuestopromoteaxonalregenerationandinducetargetnerveregeneration.Adiposemesenchymalstemcellsarewidelysour
7、cedandhavecleareffectsinthedirectionofregenerativemedicine,andexosomesplayanimportantroleinregulatingregenerationasanimportantmediatorofinformationbetweencellsofthenervoussystem.ObjectiveToexploretheeffectofadipose-derivedstemcells-derived exosomes(ADSCs-exos)on the function and early neural regener
8、ation characteristics of Schwann cells.MethodsADSCs-exoswereextractedforidentification;ADSCswereidentifiedbymicroscopicobservationandflowcytometry,and ADSCs-derived exosomes were extracted by ultracentrifugation and photographed by transmission electron microscopy;ADSCs-exoswereco-cultureddirectlywi
9、thratSchwanncellstoobservetheeffectofADSCs-exosontheproliferationofSchwanncells.EightfemaleSDratsweretaken,andmatrigelmatrixgelwasinjectedintocommercialsiliconetubeswithADSC-exostoconstructnervegraftsfortheexosomegroup;matrigelwasinjectedintocommercialsiliconetubeswithPBSfortheemptycathetergroup(Hol
10、low),with4ratsineachgroup.The1cmsciaticnervedefectmodelwasconstructed,andthenervegraftsweresuturedbetweentheproximalanddistalnervestumpsandplacedbackinthecageaftersuturingthewound.At3weeksafterremovalofthenervegrafts,theaxonalregenerationwasevaluated.ResultsADSCsweresuccessfullyextractedandwereablet
11、oexpresstheMSC收稿日期:2022-12-08基金项目:国家自然科学基金面上项目(32171356)作者简介:任致奇,男,在读硕士。研究方向:周围神经损伤修复。Email:通信作者:尚爱加,男,主任医师,教授。Email:694解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023,44(6)https:/surfacemarkerproteinsCD73,CD90,andCD105.ADSCs-exosweresuccessfullyextractedandthephospholipidbilayerstructurecould be observed
12、under transmission electron microscopy.In the co-culture system of ADSCs-exos and Schwann cells,theproliferationofSchwanncellsat24hand48hwascompared,andtheproliferationofSchwanncellsshowedasignificantdose-dependentrelationshipwiththeconcentrationofADSC-exos.Theresultsofanimalexperimentsshowedthataxo
13、nalgrowthwassignificantlybetterintheexosomegroupthanthatintheHollowgroupatthreeweeks(P0.05).ConclusionADSCs-exoscanpromotetheproliferationofSchwanncells,andtheaxongrowthlengthofADSCs-exo-loadedneuralgraftsissuperiorat3weeks.Keywords:peripheralnerveinjury;adipose-derivedstemcells;exosomes;repair;Schw
14、anncellCited as:RenZHQ,ShangAJ,YangBY,etal.Effectsofadipose-derivedmesenchymalstemcellexosomesonSchwanncellproliferationandearlynerveregenerationJ.AcadJChinPLAMedSch,2023,44(6):694-699.周围神经损伤(peripheralnerveinjury,PNI)发病率高,约占创伤患者的 2.8%,国内每年新增周围神经损伤病例 30 万50 万1。近年来,间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)移植
15、被认为是治疗周围神经损伤的新方法。目前临床上应用研究较多的主要干细胞为自体脂肪间充质干细胞(adiposederivedstemcells,ADSCs)和自体骨髓间充质干细胞(bonemarrowstromalstemcells,BMSCs),自体干细胞移植由于不存在免疫排斥和伦理学问题而具有广阔的应用前景,但关于 MSCs的植入和归巢能力下降、存活率低和分化能力受损也一直存在争议,加之成瘤性等问题,限制了其临床应用潜力2。已有较多研究表明 MSCs 通过旁分泌发挥作用,故使用 MSCs 分泌组的无细胞治疗在再生医学领域可能是一种更好的选择3。外泌体被认为参与了许多生物学过程,并参与细胞间通信
16、。外泌体具有典型的磷脂双层膜结构,携带着各种与细胞间通信相关物质4。已有研究表明间充质干细胞来源外泌体调控 miRNA 细胞间运输和表达促进轴突生长,介导生长因子促进轴突再生,并使施万细胞与炎症细胞相互协调以促进神经再生5-6。目前动物研究大多聚焦于外泌体对周围神经损伤后的长期作用,本实验尝试在体外探索脂肪间充质干细胞来源外泌体(adipose-derivedstemcells-derivedexosomes,ADSCs-exos)对施万细胞增殖的影响;在大鼠坐骨神经缺损模型上使用 ADSCs-exos,探索短期(3 周)内 ADSCs-exos对周围神经损伤修复的影响,通过短期周围神经免疫组
17、化染色评价其对神经轴突生长的影响。材料与方法1实验动物健康雌性 SD 大鼠 8 只,8 周龄,体质量 200250g,用于构建坐骨神经 1cm 缺损模型。健康雌性 SD 大鼠 3 只,3d 龄,用于提取ADSCs。所有动物由解放军总医院动物实验中心提供,获解放军总医院实验动物伦理委员会批准。2主要试剂DMEM 培养基(Gibco);胎牛血清(fetalbovineserum,FBS;Gibco);磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline,PBS;Gibco);青链霉素溶液(Gibco);0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco);型 胶 原 酶(Sigma);CD90 抗
18、体(BDPMG);CD105 抗 体(Novus);CD45 抗 体(BDPMG);CD90 抗 体(BDPMG);CD73 抗 体(BIORBYT);Neurobasal 培养基(Gibco);10%山羊血清(Solar-bio);70m 细胞筛网(Millipore);体视显微镜(NikonDSRi2);胰酶(Gibco15050065);阿糖胞苷(Sigma C6645);PBS(Corning 21-031-CV);FBS(Gibco10099-141)T25/T75 培养瓶;3%戊巴比妥钠注射液(上海玉研);75%乙醇(京试剂);兔来 源 S100 单 克 隆 抗 体(Sigma);
19、小 鼠 来 源NF200 单 克 隆 抗 体(Sigma N0142);山 羊 抗 兔IgG/Alexa Fluor594(Abcam);山 羊 抗 小 鼠IgG/AlexaFluor488(Abcamab150117);DAPI染色液(四正柏生 FXP139-100);Matrigel 基质胶(Corning354230)。3脂肪间充质干细胞的提取取 3dSD 雌性大鼠 3 只,颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡消毒5min 后转移入超净台。无菌条件下取出腹股沟脂肪组织,用含 5%双抗的 PBS 漂洗 3 遍后移入青霉素瓶中,用已灭菌的眼科剪将脂肪组织剪成1mm3的碎块。加入 7.5mL 含 0
20、.1%型胶原酶的 DMEM,放入磁珠,把青霉素小瓶放在 37 培养箱中的磁力搅拌器消化 30min。消化好后加入7.5mL 含 FBS 的 DMEM(低糖 10%)终止消化,用滤网滤过。收集消化液 1500r/min 离心 5min,弃上清。用间充质干细胞专用培养基 DMEM 重悬沉淀。接种于小培养瓶中,置于 37、5%CO2细胞培养箱中培养,48h 后首次换液,并继续培养。4脂肪间充质干细胞的鉴定光学显微镜下观察 P3 代脂肪间充质干细胞,消化重悬脂肪间充质干细胞做流式细胞学检测。5脂肪间充质干细胞来源外泌体的提取正常处理的 ADSCs 传至 34 代,待细胞长至 70%80%,更换无外泌体
21、血清培养基后培养 48h,收集解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023,44(6)https:/695上清。4 下 300g 离心 10min 去除活细胞收集上清,再 2000g 离心去除死细胞后收集上清,至解放军总医院转化中心使用超速离心机 10000g 离心30min 去除细胞碎片,收集上清后 4 下 100000g超速离心 90min,沉淀以 PBS 重悬;再次 100000g离心 90min,沉淀以 400gPBS 重悬,得到外泌体。并使用 BCA 蛋白分析试剂盒进行检测。6脂肪间充质干细胞外泌体的鉴定透射电镜拍摄提取的 ADSCs 来源外泌体。
22、7施万细胞的提取、纯化及培养配制施万细胞基础培养基:DMEM/F-12、10%FBS、2mmol/LGlutaMAX-I、1青-链霉素双抗;施万细胞纯化培养基:施万细胞基础培养基添加 10mol/L 阿糖胞苷。施万细胞完全培养基:施万细胞基础培养基添加 2mol/L 毛喉素、10ng/mLEGF-D。取 12hSD 乳鼠 4 只,经颈椎脱臼法处死后置入 75%乙醇浸泡消毒 10min,取 710mm 坐骨神经后,冲洗血迹并以 119 的比例混合液胰酶、型胶原酶、DF-12 的混合液消化 30min。消化后离心并弃掉上清,加入 4mL 施万细胞基础培养基,吹打1020 次,至无明显组织块,转移至
23、35mm2培养瓶中,于37、5%CO2环境下培养。24h 后更换施万细胞纯化培养基,抑制并杀死成纤维细胞达到纯化干细胞的目的。培养 72h 后更换施万细胞完全培养基,增殖施万细胞。8脂肪间充质干细胞外泌体与施万细胞共培养BCA 试剂盒测量 ADSCs-exos 浓度,分别设为5g/mL、10g/mL、20g/mL 三组。消化状态良好的 P3 代干细胞制成均匀细胞悬液,96 孔细胞培养板中,每孔 100L。待干细胞完全贴壁后加入配制好的不同浓度 ADSCs-exos。分别在培养24h、48h 后加入 10LCCK-8 试剂,继续在37 温箱培养 4h。分别测定 450nm 波长处吸光值,反映活细
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