重组大肠杆菌生产TaqDNA聚合酶发酵工艺优化.pdf
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1、生物工程 第 31 卷 2023 年 第 4 期 154 DOI:10.16210/ki.1007-7561.2023.04.021 肖云,陈洁.重组大肠杆菌生产 TaqDNA 聚合酶发酵工艺优化J.粮油食品科技,2023,31(4):154-161.XIAO Y,CHEN J.Optimization of fermentation process for Taq DNA polymerase production by recombinant escherichia coliJ.Science and Technology of Cereals,Oils and Foods,2023,31
2、(4):154-161.重组大肠杆菌生产 TaqDNA 聚合酶 发酵工艺优化 肖 云,陈 洁(武汉职业技术学院 生物工程学院,湖北 武汉 430072)摘 要:Taq DNA 聚合酶是 PCR 技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产 Taq DNA 聚合酶的产量,以 Taq DNA 聚合酶产量和酶的比活力为考察指标,通过单因素实验优化产生 TaqDNA 聚合酶含量的单因素:发酵温度、pH 值、IPTG 诱导剂用量、诱导时间、接种量,结果表明:发酵温度、pH 值、IPTG 诱导剂浓度,对该基因工程菌发酵产 Taq DNA 聚合酶的比酶活力有显著影响,而诱导培养时间、接种量对产 Taq D
3、NA 聚合酶的比酶活力影响不显著。故选择发酵温度、pH 值、IPTG 诱导剂浓度作为响应面的三个因素优化重组大肠杆菌生产 Taq DNA 聚合酶发酵工艺,响应面分析结果显示对酶的比活力显著性顺序为:IPTG 诱导剂浓度发酵温度pH 值,最佳发酵工艺参数为:发酵温度37.2,pH 值为 7.5,IPTG 诱导剂浓度为 0.800 mmol/L,在此条件下发酵,Taq DNA 聚合酶比活力达到(43.8220.878)kU/mg。关键词:重组大肠杆菌;Taq DNA 聚合酶;酶比活力;发酵工艺;响应面分析法 中图分类号:Q815 文献标识码:A 文章编号:1007-7561(2023)04-015
4、4-08 Optimization of Fermentation Process for Taq DNA Polymerase Production by Recombinant Escherichia coli XIAO Yun,CHEN Jie(College of Bioengineering,Wuhan Polytechnic,Wuhan,Hubei 430072,China)Abstract:Taq DNA polymerase is a thermostable enzyme and widely used in PCR technology.In order to improv
5、e the production of Taq DNA polymerase by recombinant Escherichia coli,in this study the enzyme yield and specific activity of the enzyme were taken as the inspection indicators.The single factors producing Taq DNA polymerase content were optimized through single factor test:fermentation temperature
6、,pH,amount of IPTG inducer,induction time,and inoculation amount.The results showed that fermentation temperature,pH,concentration of IPTG inducer had a significant impact on the specific enzyme activity of Taq DNA polymerase produced by the genetic engineering strain,while induction culture time an
7、d 收稿日期:2023-03-17 基金项目:武汉职业技术学院校级项目(2022YK035)Supported by:Project of Wuhan Vocational and Technical College(No.2022YK035)作者简介:肖云,女,1980 年出生,硕士,副教授,研究方向为现代生物技术。E-mail: 第 31 卷 2023 年 第 4 期 生物工程 155 inoculation amount had no significant impact on the specific enzyme activity of Taq DNA polymerase prod
8、uced by the genetic engineering strain.So fermentation temperature,pH and IPTG inducer concentration were selected as three factors of response surface to optimize the fermentation process of recombinant Escherichia coli for Taq DNA polymerase production.The response surface analysis results showed
9、and that the order of significance for the specific activity of enzymes were:IPTG inducer concentrationfermentation temperaturepH,and the optimal fermentation process parameters were:fermentation temperature 37.2,pH 7.5,IPTG inducer concentration 0.800 mmol/L.Under this condition,the specific activi
10、ty of Taq DNA polymerase reached(43.8220.878)kU/mg.Key words:recombinant Escherichia coli;Taq DNA polymerase;specific activity of enzyme;fermentation process;response surface methodology 聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学领域最重要的研究工具之一。在 PCR 技术中,DNA聚合酶起着关键性作用1。PCR 反应扩增 DNA 是在高温条件下进行的,因此需要一种热稳定的酶。Taq DNA 聚合酶最初是从嗜热杆菌(T
11、hrmus aquaticus)中分离纯化得到的热稳定性 DNA 聚合酶,是 PCR 反应中最常用的一种 DNA 聚合酶2。而目前大多数实验室主要依赖公司商品化的 Taq DNA 聚合酶3-4。利用重组大肠杆菌生产 Taq DNA 聚合酶不但可以解决原始菌株产量低,而且可以通过简化纯化步骤,缩短工艺生产流程,为大规模生产 Taq DNA 聚合酶打下基础。由于 Taq DNA 聚合酶在 PCR 中的广泛应用,有关该酶的制备技术一直在不断地优化提高5。为了不断提高该酶的表达量、酶活力和特异性,很多研究主要是针对酶基因本身,表达载体的构建,分离纯化方法。但是对于重组耐热 Taq DNA聚合酶在大肠杆
12、菌中发酵生产的最佳表达条件的研究鲜有报道6。本文在前期研究的基础上,考察重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶发酵工艺条件。研究通过单因素以及响应面法优化重组大肠杆菌生产 Taq DNA 聚合酶的发酵工艺,进而提高Taq DNA 聚合酶的产量,为 Taq DNA 聚合酶的工业化生产提供一定的指导。1 材料与方法 1.1 材料 E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-Taq:华中农业大学国家微生物重点实验室提供,菌种保存于80 冰箱中;卡那霉素(Kan)、异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker 等生物化学试剂:上海如吉生物科技发展有限公司。
13、实验中所用培养基主要有 LB 液体培养基和LB 固体培养基及大肠杆菌发酵培养基。Kan 用无菌水配制,50 mg/mL 的母液放置 4 保存添加抗生素时,须在培养基冷却至室温时再添加适量的抗生素,避免抗生素在高温时失效。LB 固体培养基配方:蛋白胨 10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂 15 g/L、1 000 mL 蒸馏水,调节 pH 值至 7.07.5。LB 液体培养基配方:蛋白胨 10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、1 000 mL 蒸馏水,调节 pH值至 7.07.5。1.2 仪器与设备 PHM100 全自动手动高温蒸汽灭菌器:武汉集思仪器设
14、备有限公司;SW-CJ-1D 型超净工作台:力辰科技有限公司;HT-211A 型摇床:上海赫田科学仪器有限公司;DNP-9082 型恒温培养箱:宁波江南仪器厂;TC1000-G PCR 仪:北京大龙 DLAB。1.3 实验方法 1.3.1 培养与发酵条件 挑取冻存于80 环境的 E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-Taq 工程菌,接到 5 mL 含 Kan 抗性的培养液里 37、180 rpm 振荡一夜。接 种 100 L 活 化 的 E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-Taq 于 10 mL 含有卡拉霉素(10 g/mL)的 LB 培养液中,37,250
15、r/min 培养过夜;次生物工程 第 31 卷 2023 年 第 4 期 156 日,取培养过夜的菌液 10 mL,接种于 1 L 含有卡拉霉素(10 g/mL)的 LB 培养液中,250 r/min培养至对数生长中期(OD600=0.50.6);向培养液中加入诱导物 IPTG,诱导培养一定时间7。1.3.2 样品的提取 将诱导菌液 4,12 000 r/min 离心 5 min,弃去上清液,沉淀重悬于 0.01 mol/L PBS(pH 8.0)中;超声波冰浴破壁,破碎产物经 4,12 000 r/min离心 15 min 后取上清液;0.45 m 微孔滤膜过滤上清液,Ni-NTA 亲和层析
16、,洗脱用含有 500 mmol/L咪唑的 0.01 mol/L PBS(pH 8.0)洗脱,得到重组蛋白溶液7。1.3.3 酶含量的测定考马斯亮蓝结合法 标准试剂的配制(考马斯亮蓝 G-250)8:精确称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250,溶于 95%的乙醇中,与 100 mL 85%W/V 的磷酸混合,用 0.01%M pH 7.0 磷酸缓冲液定溶到 1 L,棕色瓶,4 保存。并配置 0.01%NaCl 溶液。利用标准曲线测定样品的酶蛋白浓度。为了比较酶制剂的纯度和活力的高低,常常采用比活力这个参数。酶的比活力是酶纯度的一个指标,是指在特定条件下,单位质量(mg)蛋白质所具有的酶活力单
17、位。1.3.4 酶活单位测定 以购买的 Taq DNA聚合酶进行梯度稀释:12、15、110、115、120。在 PCR 反应中,取相同体积不同稀释度的Taq DNA聚合酶量进行凝胶电泳作为标准梯度;同时,将自制的酶也采用不同的上样量,进行 PCR 扩增,凝胶电泳,在凝胶成像系统仪下观察条带的亮度,确定酶的活力及酶的比活力。1.3.5 单因素实验 采用单因素实验依次对发酵温度、pH、IPTG诱导剂用量、诱导时间、接种量等发酵工艺参数进行逐一优化9-10。每组实验重复 3 次,对其代谢产物进行含量和酶活力测定,优化能产生 Taq DNA 聚合酶含量最大的单因素发酵温度、pH、IPTG 诱导剂用量
18、、诱导时间、接种量11。1.3.6 响应面分析法优化发酵培养基及发酵条件 根据 1.2.5 单因素实验结果,以筛选出 IPTG 诱导剂用量、诱导时间和接种量作为实验因素12-13,以 Taq DNA 聚合酶含量为响应值,采用响应面实验设计 Design-Expert 12 软件的 Box-Behnken 设计三因素三水平的实验,并利用响应面法对菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-Taq 最佳发酵工艺进行优化。1.4 模型的验证实验 将优化后的最佳预测值进行发酵实验,重复3 次,取平均值。比较预测值和实验所得到的实际值,进一步验证响应面法所得到的预测值,来确定响应面法优化的
19、发酵工艺是否准确可靠,是否具有实际的应用价值。2 结果与讨论 2.1 制备酶蛋白标准曲线 以酶蛋白浓度为横坐标,A595 为纵坐标,得到酶蛋白浓度 C 和吸光值 A595 线性回归曲线,其方程为 y=13.04x0.000 9,R2=0.999 3,方程式中 x 为酶蛋白质浓度,y 为吸光值。酶蛋白标准曲线见图 1。图 1 酶蛋白标准曲线 Fig.1 Standard curve of enzyme protein 2.2 单因素实验结果 2.2.1 发酵温度对 Taq DNA 聚合酶产量和酶比活力的影响 其它发酵条件保持不变,只改变温度,发酵后测 Taq DNA 聚合酶产量和酶比活力。结果如
20、图2 所示。从图 2 可以看出,在 2742 发酵条件下,菌体的酶产量和酶比活力随着温度升高而逐渐升高,但是当温度超过 37 后,随着温度的升高,酶产量和酶比活力反而下降。可能原因是菌体的生长和产物的合成都是在酶的催化下进行的,而温度是保证酶活性的重要因素,当温度为 37 第 31 卷 2023 年 第 4 期 生物工程 157 时,Taq DNA 聚合酶产量和酶比活力最大,故为最适发酵温度。图 2 温度对 Taq DNA 聚合酶产量和酶比活力的影响 Fig.2 Effect of standard curve temperature of enzyme protein on the yiel
21、d and specific activity of Taq DNA polymerase 2.2.2 pH 对 Taq DNA 聚合酶产量和酶比活力的影响 其它发酵条件保持不变,只改变 pH,发酵后测 Taq DNA 聚合酶产量和酶比活力。结果如图 3所示。图 3 pH 值对 Taq DNA 聚合酶产量和酶比活力的影响 Fig.3 Effect of pH on the yield and specific activity of Taq DNA polymerase 从图 3 可以看出,当 pH 值为 6.07.0 时,菌体的酶产量和酶比活力明显增加,但是当 pH 超过 7.0 后,随着温
22、度的升高,酶产量和酶比活力反而下降。可能原因是酸性和碱性环境对菌体生长和酶的合成产生了抑制作用,导致酶比活力下降。故选择最适发酵 pH 为 7.0。2.2.3 IPTG 诱导剂用量对 Taq DNA 聚合酶产量和酶比活力的影响 其它发酵条件保持不变,只改变 IPTG 诱导剂用量,发酵后测 Taq DNA 聚合酶产量和酶比活力。结果如图 4 所示。图 4 IPTG 浓度对 Taq DNA 聚合酶产量和酶比活力的影响 Fig.4 Effect of IPTG concentration on Taq DNA polymerase yield and specific activity 从图 4 可
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