一种由口腔菌群失衡引起的大鼠口臭模型的构建及其评价.pdf
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1、作者简介 黄志强(1 9 9 6),男,四川资阳市人,硕士在读,主要从事消化系菌群及内镜治疗研究。*通信作者 程永波,E-m a i l:c h e n g y b 2 0 0 11 6 3.c o m其他口腔疾病研究一种由口腔菌群失衡引起的大鼠口臭模型的构建及其评价黄志强 程永波*新疆医科大学第一附属医院消化病一科 新疆 乌鲁木齐 8 3 0 0 5 4 摘要 目的:利用口源性口臭(I n t r a-o r a l h a l i t o s i s,I OH)患者唾液整体微生物群定植构建大鼠口臭模型,通过检测大鼠口腔相关微生物、相关代谢和口气值变化对该模型的可行性进行评价。方法:将健康的
2、68周龄雄性W i s t a r大鼠随机分为两组,模型组(H组)和对照组(C组)。均适应性饲养1周后麻醉下进行口腔菌群采样并检测口气值,使用蘸有生理盐水的棉签机械清洗两组大鼠的牙齿和黏膜。再常规饲养1周后重复清洗并使用0.1%N a o C l冲洗口腔黏膜和牙齿5 m i n,随后用2 3 m o l/L缓冲抗坏血酸钠冲洗1 0 m i n。使用加入保护液的I OH患者唾液整体微生物群涂抹H组大鼠牙齿和口腔黏膜,每日1次,涂抹后禁食水1 h,后持续给予1 0%高糖水,6周后麻醉下口腔菌群 采样。同 时常 规 饲 养C组 并 采 样。采 用1 6 S r R NA测 序 技 术 检 测 大 鼠
3、 口 腔 微 生 物 变 化,使 用P I C RU S t进行菌群代谢功能预测,利用H a l i m e t e r口气检测仪每2周检测大鼠口气值。结果:与C组相比,H组口腔菌群中卟啉单胞菌属(P o r p h y r o m o n a s)、梭杆菌属(F u s o b a c t e r i u m)、孪生球菌属(G e m e l l a)、纤毛菌属(L e p t o-t r i c h i a)和消化链球菌属(P e p t o s t r e p t o c o c c u s)等与I OH相关的物种比例明显升高。P I C RU S t代谢预测分析表明,与C组相比,H组口
4、臭相关代谢途径明显增强。同时口气检测值也出现显著升高。结论:该造模方法可使I OH相关微生物定植大鼠口腔并发挥其产臭功能,很好的模拟了临床患者口腔菌群和口气特征,可用于未来I OH新的治疗方式和疾病发生发展的研究中。关键词 口源性口臭;口腔菌群;动物模型 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 17 6 5 1(2 0 2 3)0 80 7 4 50 6d o i 1 0.1 3 7 0 1/j.c n k i.k q y x y j.2 0 2 3.0 8.0 1 5E s t a b l i s h m e n t a n d E v a l u a t i o n o f A R a t
5、M o d e l o f H a l i t o s i s C a u s e d b y I m b a l a n c e o f O r a l F l o r a.HU ANG Z h i q i a n g,CHENG Y o n g b o*.D e p a r t m e n t o f G a s t r o e n t e r o l o g y I,T h e F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f X i n j i a n g M e d i c a l U n i-v e r s i t y,U r u
6、m q i 8 3 0 0 5 4,C h i n a.A b s t r a c t O b j e c t i v e:T o c o n s t r u c t a r a t h a l i t o s i s m o d e l u s i n g s a l i v a r y h o l i s t i c m i c r o b i o t a c o l o n i z a t i o n i n p a t i e n t s w i t h i n t r a-o r a l h a l i t o s i s(I OH),a n d t o e v a l u a t
7、e t h e f e a s i b i l i t y o f t h e m o d e l b y d e t e c t i n g t h e c h a n g e s o f o r a l-a s s o c i a t-e d m i c r o o r g a n i s m s,a s s o c i a t e d m e t a b o l i s m,a n d b r e a t h v a l u e s i n r a t s.M e t h o d s:T h e h e a l t h y 6-8 w e e k-o l d m a l e W i s
8、t a r r a t s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o t w o g r o u p s,t h e m o d e l g r o u p(G r o u p H)a n d t h e c o n t r o l g r o u p(G r o u p C).O r a l f l o r a s a m p l i n g w a s p e r f o r m e d a n d b r e a t h v a l u e s w e r e m e a s u r e d u n d e r a n e s t h e
9、 s i a a f t e r 1 w e e k o f a c c l i m a t i z a-t i o n,m e c h a n i c a l c l e a n i n g o f t h e t e e t h a n d m u c o s a o f b o t h g r o u p s o f r a t s u s i n g c o t t o n s w a b s d i p p e d i n s a l i n e.T h e c l e a n i n g w a s r e p e a t e d a n d t h e o r a l m u c
10、 o s a a n d t o o t h w e r e r i n s e d w i t h 0.1%N a o C l f o r 5 m i n a f t e r 1 w e e k o f r o u t i n e f e e d i n g,f o l l o w e d b y a 1 0 m i n r i n s e w i t h 2 3 M b u f f e r e d s o d i u m a s c o r b a t e.T o o t h a n d o r a l m u c o s a o f r a t s i n g r o u p H w e
11、 r e c o a t e d u s i n g s a l i v a r y h o l i s t i c m i c r o b i o t a o f I OH p a t i e n t s a d d e d w i t h p r o t e c t i v e s o l u t i o n o n c e d a i l y,w i t h w a-t e r a n d f o o d f a s t i n g f o r 1 h a f t e r a p p l i c a t i o n,f o l l o w e d b y c o n t i n u o
12、u s a d m i n i s t r a t i o n o f 1 0%h i g h s u g a r w a t e r,a n d o-r a l f l o r a s a m p l i n g u n d e r a n e s t h e s i a f o r 6 w e e k s.G r o u p C w a s a l s o r o u t i n e l y r e a r e d a n d s a m p l e d.T h e 1 6 S r R NA s e-q u e n c i n g t e c h n i q u e w a s u s e
13、 d t o d e t e c t m i c r o b i a l c h a n g e s i n t h e r a t o r a l c a v i t y,t h e P I C RU S t w a s u s e d t o p r e d i c t t h e m e t a b o l i c f u n c t i o n o f t h e f l o r a,a n d t h e H a l i m e t e r b r e a t h d e t e c t o r w a s u s e d t o t e s t t h e b r e a t h
14、v a l u e s o f t h e r a t s e v e r y 2 w e e k s.R e s u l t s:C o m p a r e d w i t h g r o u p C,t h e p r o p o r t i o n o f I OH-a s s o c i a t e d s p e c i e s s u c h a s p o r p h y r o m o n a s,f u s o-b a c t e r i u m,g e m e l l a,l e p t o t r i c h i a,a n d p e p t o s t r e p t
15、 o c o c c u s i n t h e o r a l f l o r a o f g r o u p H w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r.P I C RU S t m e t a b o l i c p r e d i c t i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e m e t a b o l i c p a t h w a y s a s s o c i a t e d w i t h h a l i t o s i s w e r e s i g n i f i-c
16、a n t l y e n h a n c e d i n g r o u p H c o m p a r e d w i t h g r o u p C.T h e r e w a s a l s o a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n b r e a t h t e s t v a l u e s.C o n c l u-s i o n:T h i s m o d e l i n g m e t h o d a l l o w s I OH-r e l a t e d m i c r o o r g a n-i s m s t o c o
17、 l o n i z e t h e o r a l c a v i t y o f r a t s a n d e x e r t t h e i r o d o r-547 口腔医学研究2 0 2 3年8月第3 9卷第8期p r o d u c i n g f u n c t i o n a n d w e l l s i m u l a t e s t h e o r a l f l o r a a n d b r e a t h c h a r a c t e r i s t i c s o f c l i n i c a l p a t i e n t s,a n d c a n b
18、 e u s e d i n f u t u r e r e s e a r c h o n n e w t r e a t m e n t m o d a l i t i e s a n d d i s e a s e d e v e l o p m e n t o f I OH.K e y w o r d s i n t r a-o r a l h a l i t o s i s;o r a l f l o r a;a n i m a l m o d e l s 口腔菌群是仅次于肠道的第二大复杂生态系统,它是口腔黏膜屏障和免疫反应的关键组成部分,长期保持着动态平衡,在抵御病原体入侵和防治口
19、腔疾病方面发挥着重要作用1。口腔微生态的失衡引起和加重了许多口腔疾病,如口源性口臭(i n t r a-o r a l h a l i t o s i s,I OH)。在I OH中,环境、免疫和用药等多种因素相互作用造成了口腔菌群的紊乱,长期的菌群失衡破坏了口腔黏膜屏障,造成局部免疫激活,为产臭菌的定植提供了适宜条件,进而不断建立以产臭微生物群为核心的菌群共生网络2。它们不仅可将口腔内 的含硫底 物分解 为 挥 发 性 硫 化 物(v o l a t i l e s u l f u r c o m p o u n d s,V S C s),而且其代谢产物可产生粪臭素、尸胺、腐胺和吲哚等物质,二
20、者共同导致口腔恶臭3。然而,反复出现的症状和长期机械化学治疗的副作用使大多数中青年患者不愿社交,产生极大的心理负担,甚至性格发生改变,严重影响身心健康4,5。口臭在全世界范围内极其常见,而I OH占比高达8 5%6。随着现代社会的发展,越来越多的人跳出舒适圈,想要缓解甚至根治口臭的人也越来越多。目前常规治疗方式都仅可在一段时间内缓解口臭,远期效果并不乐观,因此深入了解I OH的发生发展,开发针对性的治疗方式是未来长期缓解甚至根治I OH的有效途径之一,而新兴治疗方式的动物模型验证是判断其有效性和安全性的主要手段。因此,模拟出具有口臭症状和微生物特点的动物模型是研究治疗新策略的前提。W i s
21、t a r大鼠口腔菌群结构与人相似,加之其性情温顺、易于饲养,已广泛用于口腔菌群相关疾病的研究当中。因此,本研究使用经过口腔原始菌群清除的W i s t a r大鼠,通过定植I OH患者口腔中最具代表性的唾液整体菌群来建立大鼠模型,并且通过检测大鼠口气值、微生物结构及代谢变化来评价此模型,最终发现该模型在上述方面与临床患者表现一致,认为此模型在未来I OH发生发展和新的治疗方式研究中具有重要作用。1 材料与方法1.1 材料与试剂 羧甲基纤维素钠(2 5 g)与抗坏血酸钠(1 0 0 g)均购自北京索莱宝科技有限公司,货号分别为C 8 6 2 1和S 9 4 4 0。次氯酸钠溶液(5 0 0 m
22、 L)与甘油(5 0 0 m L)购自上海麦克林生化科技有限公司,货号分别为S 8 1 7 4 4 1和G 6 2 0 1。P B S(5 0 0 m L)购自北京希诺因子科技有限公司,货号为C B S 0 0 4 S-B R 5 0 0。异氟烷(1 0 0 m L)购自河北金达福药业有限公司,批号为2 0 2 2 0 2 0 2。1.2 大鼠饲养 饲养环境:温度1 82 6、昼夜交替1 2 h,所有大鼠每5 d更换1次垫料。食水:定制的无特定病原体食水,定植前均不限制食水,定植后H组给予浓度为1 0%的高糖水。1.3 仪器与设备 H a l i m e t e r口气检测仪,美国I n t
23、e r s c a n C o r p o r a t i o n;小动物气体麻醉机,瑞沃德生命科技有限公司;N a n o d r o p,T h e r m o S c i e n t i f i c;电泳仪,北京六一生物科技有限公司;凝胶成像系统,北京百晶生物技术有限公司;P C R扩增仪,A B I;酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;台式高速离心机,E p p e n d o r f;-8 0 冰箱,T h e r m o F i s h e r。1.4 实验方法1.4.1 动物模型 本研究由新疆医科大学实验动物伦理委员会审批(批号:I A C U C-2 0 2 1 0 4 0 5-1
24、4),全程严格遵循动物伦理原则。将68周龄全身健康、平均体重(2 8 3.2 12 9.8 2)g、雄性S P F级W i s t a r大鼠随机分为模型组(H组)和对照组(C组),每组4只。均饲养于新疆医科大学动物实验中心普通环境。适应性饲养1周后,在异氟烷气体诱导麻醉下(流量4 L/m i n,浓度4%)使用无菌拭子进行口腔菌群采样,使用H a l i m e t e r口气检测仪检测口腔气体初始值,使用蘸有生理盐水的棉签机械清洗两组大鼠的牙齿和黏膜3次。再常规饲养1周后麻醉下重复清洗3次,使用现配的0.1%N a o C l冲洗口腔黏膜和牙齿5 m i n,随后用现配的2 3 m o l
25、/L缓冲抗坏血酸钠冲洗1 0 m i n灭活7。使用预先加入增稠剂(2%羧甲基纤维素钠)和保护液(含有2 0%甘油的P B S)的I OH患者唾液整体微生物2 m L涂抹于H组大鼠牙齿和口腔黏膜,每日1次,涂抹后禁食水1 h,后持续给予1 0%的高糖水,6周后麻醉下口腔菌群采样。全程常规饲养C组并与H组同步采样。所有大鼠实验过程中每2周检测口腔内气体值。所有口腔菌群样品分别置入含1.5 m L P B S的冻存管中-8 0 保存,待后续测序和生物信息分析。1.4.2 1 6 S r R NA测序分析方法 D NA提取、质检、扩增和纯化均由南京派森诺生物科技有限公司647J o u r n a
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