一种由口腔菌群失衡引起的大鼠口臭模型的构建及其评价.pdf

作者简介 黄志强(1 9 9 6),男,四川资阳市人,硕士在读,主要从事消化系菌群及内镜治疗研究。*通信作者 程永波,E-m a i l:c h e n g y b 2 0 0 11 6 3.c o m其他口腔疾病研究一种由口腔菌群失衡引起的大鼠口臭模型的构建及其评价黄志强 程永波*新疆医科大学第一附属医院消化病一科 新疆 乌鲁木齐 8 3 0 0 5 4 摘要 目的:利用口源性口臭(I n t r a-o r a l h a l i t o s i s,I OH)患者唾液整体微生物群定植构建大鼠口臭模型,通过检测大鼠口腔相关微生物、相关代谢和口气值变化对该模型的可行性进行评价。方法:将健康的68周龄雄性W i s t a r大鼠随机分为两组,模型组(H组)和对照组(C组)。均适应性饲养1周后麻醉下进行口腔菌群采样并检测口气值,使用蘸有生理盐水的棉签机械清洗两组大鼠的牙齿和黏膜。再常规饲养1周后重复清洗并使用0.1%N a o C l冲洗口腔黏膜和牙齿5 m i n,随后用2 3 m o l/L缓冲抗坏血酸钠冲洗1 0 m i n。使用加入保护液的I OH患者唾液整体微生物群涂抹H组大鼠牙齿和口腔黏膜,每日1次,涂抹后禁食水1 h,后持续给予1 0%高糖水,6周后麻醉下口腔菌群 采样。同 时常 规 饲 养C组 并 采 样。采 用1 6 S r R NA测 序 技 术 检 测 大 鼠 口 腔 微 生 物 变 化,使 用P I C RU S t进行菌群代谢功能预测,利用H a l i m e t e r口气检测仪每2周检测大鼠口气值。结果:与C组相比,H组口腔菌群中卟啉单胞菌属(P o r p h y r o m o n a s)、梭杆菌属(F u s o b a c t e r i u m)、孪生球菌属(G e m e l l a)、纤毛菌属(L e p t o-t r i c h i a)和消化链球菌属(P e p t o s t r e p t o c o c c u s)等与I OH相关的物种比例明显升高。P I C RU S t代谢预测分析表明,与C组相比,H组口臭相关代谢途径明显增强。同时口气检测值也出现显著升高。结论:该造模方法可使I OH相关微生物定植大鼠口腔并发挥其产臭功能,很好的模拟了临床患者口腔菌群和口气特征,可用于未来I OH新的治疗方式和疾病发生发展的研究中。关键词 口源性口臭;口腔菌群;动物模型 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 17 6 5 1(2 0 2 3)0 80 7 4 50 6d o i 1 0.1 3 7 0 1/j.c n k i.k q y x y j.2 0 2 3.0 8.0 1 5E s t a b l i s h m e n t a n d E v a l u a t i o n o f A R a t M o d e l o f H a l i t o s i s C a u s e d b y I m b a l a n c e o f O r a l F l o r a.HU ANG Z h i q i a n g,CHENG Y o n g b o*.D e p a r t m e n t o f G a s t r o e n t e r o l o g y I,T h e F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f X i n j i a n g M e d i c a l U n i-v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 5 4,C h i n a.A b s t r a c t O b j e c t i v e:T o c o n s t r u c t a r a t h a l i t o s i s m o d e l u s i n g s a l i v a r y h o l i s t i c m i c r o b i o t a c o l o n i z a t i o n i n p a t i e n t s w i t h i n t r a-o r a l h a l i t o s i s(I OH),a n d t o e v a l u a t e t h e f e a s i b i l i t y o f t h e m o d e l b y d e t e c t i n g t h e c h a n g e s o f o r a l-a s s o c i a t-e d m i c r o o r g a n i s m s,a s s o c i a t e d m e t a b o l i s m,a n d b r e a t h v a l u e s i n r a t s.M e t h o d s:T h e h e a l t h y 6-8 w e e k-o l d m a l e W i s t a r r a t s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o t w o g r o u p s,t h e m o d e l g r o u p(G r o u p H)a n d t h e c o n t r o l g r o u p(G r o u p C).O r a l f l o r a s a m p l i n g w a s p e r f o r m e d a n d b r e a t h v a l u e s w e r e m e a s u r e d u n d e r a n e s t h e s i a a f t e r 1 w e e k o f a c c l i m a t i z a-t i o n,m e c h a n i c a l c l e a n i n g o f t h e t e e t h a n d m u c o s a o f b o t h g r o u p s o f r a t s u s i n g c o t t o n s w a b s d i p p e d i n s a l i n e.T h e c l e a n i n g w a s r e p e a t e d a n d t h e o r a l m u c o s a a n d t o o t h w e r e r i n s e d w i t h 0.1%N a o C l f o r 5 m i n a f t e r 1 w e e k o f r o u t i n e f e e d i n g,f o l l o w e d b y a 1 0 m i n r i n s e w i t h 2 3 M b u f f e r e d s o d i u m a s c o r b a t e.T o o t h a n d o r a l m u c o s a o f r a t s i n g r o u p H w e r e c o a t e d u s i n g s a l i v a r y h o l i s t i c m i c r o b i o t a o f I OH p a t i e n t s a d d e d w i t h p r o t e c t i v e s o l u t i o n o n c e d a i l y,w i t h w a-t e r a n d f o o d f a s t i n g f o r 1 h a f t e r a p p l i c a t i o n,f o l l o w e d b y c o n t i n u o u s a d m i n i s t r a t i o n o f 1 0%h i g h s u g a r w a t e r,a n d o-r a l f l o r a s a m p l i n g u n d e r a n e s t h e s i a f o r 6 w e e k s.G r o u p C w a s a l s o r o u t i n e l y r e a r e d a n d s a m p l e d.T h e 1 6 S r R NA s e-q u e n c i n g t e c h n i q u e w a s u s e d t o d e t e c t m i c r o b i a l c h a n g e s i n t h e r a t o r a l c a v i t y,t h e P I C RU S t w a s u s e d t o p r e d i c t t h e m e t a b o l i c f u n c t i o n o f t h e f l o r a,a n d t h e H a l i m e t e r b r e a t h d e t e c t o r w a s u s e d t o t e s t t h e b r e a t h v a l u e s o f t h e r a t s e v e r y 2 w e e k s.R e s u l t s:C o m p a r e d w i t h g r o u p C,t h e p r o p o r t i o n o f I OH-a s s o c i a t e d s p e c i e s s u c h a s p o r p h y r o m o n a s,f u s o-b a c t e r i u m,g e m e l l a,l e p t o t r i c h i a,a n d p e p t o s t r e p t o c o c c u s i n t h e o r a l f l o r a o f g r o u p H w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r.P I C RU S t m e t a b o l i c p r e d i c t i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e m e t a b o l i c p a t h w a y s a s s o c i a t e d w i t h h a l i t o s i s w e r e s i g n i f i-c a n t l y e n h a n c e d i n g r o u p H c o m p a r e d w i t h g r o u p C.T h e r e w a s a l s o a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n b r e a t h t e s t v a l u e s.C o n c l u-s i o n:T h i s m o d e l i n g m e t h o d a l l o w s I OH-r e l a t e d m i c r o o r g a n-i s m s t o c o l o n i z e t h e o r a l c a v i t y o f r a t s a n d e x e r t t h e i r o d o r-547 口腔医学研究2 0 2 3年8月第3 9卷第8期p r o d u c i n g f u n c t i o n a n d w e l l s i m u l a t e s t h e o r a l f l o r a a n d b r e a t h c h a r a c t e r i s t i c s o f c l i n i c a l p a t i e n t s,a n d c a n b e u s e d i n f u t u r e r e s e a r c h o n n e w t r e a t m e n t m o d a l i t i e s a n d d i s e a s e d e v e l o p m e n t o f I OH.K e y w o r d s i n t r a-o r a l h a l i t o s i s;o r a l f l o r a;a n i m a l m o d e l s 口腔菌群是仅次于肠道的第二大复杂生态系统,它是口腔黏膜屏障和免疫反应的关键组成部分,长期保持着动态平衡,在抵御病原体入侵和防治口腔疾病方面发挥着重要作用1。口腔微生态的失衡引起和加重了许多口腔疾病,如口源性口臭(i n t r a-o r a l h a l i t o s i s,I OH)。在I OH中,环境、免疫和用药等多种因素相互作用造成了口腔菌群的紊乱,长期的菌群失衡破坏了口腔黏膜屏障,造成局部免疫激活,为产臭菌的定植提供了适宜条件,进而不断建立以产臭微生物群为核心的菌群共生网络2。它们不仅可将口腔内 的含硫底 物分解 为 挥 发 性 硫 化 物(v o l a t i l e s u l f u r c o m p o u n d s,V S C s),而且其代谢产物可产生粪臭素、尸胺、腐胺和吲哚等物质,二者共同导致口腔恶臭3。然而,反复出现的症状和长期机械化学治疗的副作用使大多数中青年患者不愿社交,产生极大的心理负担,甚至性格发生改变,严重影响身心健康4,5。口臭在全世界范围内极其常见,而I OH占比高达8 5%6。随着现代社会的发展,越来越多的人跳出舒适圈,想要缓解甚至根治口臭的人也越来越多。目前常规治疗方式都仅可在一段时间内缓解口臭,远期效果并不乐观,因此深入了解I OH的发生发展,开发针对性的治疗方式是未来长期缓解甚至根治I OH的有效途径之一,而新兴治疗方式的动物模型验证是判断其有效性和安全性的主要手段。因此,模拟出具有口臭症状和微生物特点的动物模型是研究治疗新策略的前提。W i s t a r大鼠口腔菌群结构与人相似,加之其性情温顺、易于饲养,已广泛用于口腔菌群相关疾病的研究当中。因此,本研究使用经过口腔原始菌群清除的W i s t a r大鼠,通过定植I OH患者口腔中最具代表性的唾液整体菌群来建立大鼠模型,并且通过检测大鼠口气值、微生物结构及代谢变化来评价此模型,最终发现该模型在上述方面与临床患者表现一致,认为此模型在未来I OH发生发展和新的治疗方式研究中具有重要作用。1 材料与方法1.1 材料与试剂 羧甲基纤维素钠(2 5 g)与抗坏血酸钠(1 0 0 g)均购自北京索莱宝科技有限公司,货号分别为C 8 6 2 1和S 9 4 4 0。次氯酸钠溶液(5 0 0 m L)与甘油(5 0 0 m L)购自上海麦克林生化科技有限公司,货号分别为S 8 1 7 4 4 1和G 6 2 0 1。P B S(5 0 0 m L)购自北京希诺因子科技有限公司,货号为C B S 0 0 4 S-B R 5 0 0。异氟烷(1 0 0 m L)购自河北金达福药业有限公司,批号为2 0 2 2 0 2 0 2。1.2 大鼠饲养 饲养环境:温度1 82 6、昼夜交替1 2 h,所有大鼠每5 d更换1次垫料。食水:定制的无特定病原体食水,定植前均不限制食水,定植后H组给予浓度为1 0%的高糖水。1.3 仪器与设备 H a l i m e t e r口气检测仪,美国I n t e r s c a n C o r p o r a t i o n;小动物气体麻醉机,瑞沃德生命科技有限公司;N a n o d r o p,T h e r m o S c i e n t i f i c;电泳仪,北京六一生物科技有限公司;凝胶成像系统,北京百晶生物技术有限公司;P C R扩增仪,A B I;酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;台式高速离心机,E p p e n d o r f;-8 0 冰箱,T h e r m o F i s h e r。1.4 实验方法1.4.1 动物模型 本研究由新疆医科大学实验动物伦理委员会审批(批号:I A C U C-2 0 2 1 0 4 0 5-1 4),全程严格遵循动物伦理原则。将68周龄全身健康、平均体重(2 8 3.2 12 9.8 2)g、雄性S P F级W i s t a r大鼠随机分为模型组(H组)和对照组(C组),每组4只。均饲养于新疆医科大学动物实验中心普通环境。适应性饲养1周后,在异氟烷气体诱导麻醉下(流量4 L/m i n,浓度4%)使用无菌拭子进行口腔菌群采样,使用H a l i m e t e r口气检测仪检测口腔气体初始值,使用蘸有生理盐水的棉签机械清洗两组大鼠的牙齿和黏膜3次。再常规饲养1周后麻醉下重复清洗3次,使用现配的0.1%N a o C l冲洗口腔黏膜和牙齿5 m i n,随后用现配的2 3 m o l/L缓冲抗坏血酸钠冲洗1 0 m i n灭活7。使用预先加入增稠剂(2%羧甲基纤维素钠)和保护液(含有2 0%甘油的P B S)的I OH患者唾液整体微生物2 m L涂抹于H组大鼠牙齿和口腔黏膜,每日1次,涂抹后禁食水1 h,后持续给予1 0%的高糖水,6周后麻醉下口腔菌群采样。全程常规饲养C组并与H组同步采样。所有大鼠实验过程中每2周检测口腔内气体值。所有口腔菌群样品分别置入含1.5 m L P B S的冻存管中-8 0 保存,待后续测序和生物信息分析。1.4.2 1 6 S r R NA测序分析方法 D NA提取、质检、扩增和纯化均由南京派森诺生物科技有限公司647J o u r n a l o f O r a l S c i e n c e R e s e a r c h,A u g.2 0 2 3,V o l.3 9,N o.8 完成。1 6 S r R NA扩增区域为V 3-V 4保守区,引物为F:A C T C C T A C G G GAG G C AG C A;R:G GA C-T A CHVG G G TWT C T AAT。P C R扩 增 步 骤 为9 8 预变性2 m i n;9 8变性1 5 s;5 5 退火3 0 s;7 2 延伸3 0 s,共2 53 0个周期;7 2 最终延伸5 m i n。扩增后的D NA通过N o v a s e q-P E 2 5 0测序平台进行双端测序。选择Q I I ME 2 d a d a 2分析流程对序列进行去噪,产生的去重序列A S V s以1 0 0%的相似度进行聚类。采用S i l v a数据库8,c l a s s i f y-s k l e a r n算 法9,对 于 每 个A S V s的 特 征 序 列,在Q I I ME 2软 件 中 使 用 默 认 参 数 和 预 先 训 练 好 的N a i v e B a y e s分类器进物种注释。1.4.3 P I C RU S t功能预测分析方法 将测序数据从功能差异层面进行聚类,在K E G G数据库中,使用P I C RU S t进行菌群代谢功能预测。因产生I OH的主要物质是V S C s且部分其他致臭物质也可通过代谢含硫氨基酸产生,故尤其关注硫及含硫氨基酸的代谢。1.4.4 口气检测方法 使用H a l i m e t e r口气检测仪,按照使用说明检测大鼠口腔气体值。实验过程中口气检测每2周1次,每次检测前均使用异氟烷气体麻醉后固定,检测重复3次,间隔5 m i n,取平均值。1.4.5 统计学分析 数据均采用xs描述,使用S P S S 2 6.0软件进行数据处理。组间比较采用两独立样本t检 验 和 秩 和 检 验(M a n n-Wh i t n e y U检验)。检验水准均为=0.0 5。2 结果2.1 I OH患者唾液整体微生物群定植引起大鼠口腔菌群变化 研究表明,I OH发生主要表现为相关产臭菌的定植增加,如具核梭杆菌(F u s o b a c t e r i u m n u c l e a t u m)、牙龈卟啉单胞菌(P o r p h y r o m o n a s g i n-g i v a l i s)、齿密垢螺旋体(T r e p o n e m a d e n t i c o l a)、摩尔梭 菌(S o l o b a c t e r i u m m o o r e i)、中 间 普 雷 沃 菌(P r e v o t e l l a i n t e r m e d i a)、福 赛 斯 坦 纳 菌(T a n-n e r e l l a f o r s y t h i a)、消 化 链 球 菌(P e p t o s t r e p t o c o c-c u s)和纳米细菌(n a n o b a c t e r i a)等1 0-1 3。本研究两组初始口腔菌群在丰度排名前2 0的菌属中差异均不显著,提示两组间一致性较好,见表1。I OH患者唾液整体微生物群定植6周后,与C组相比,H组菌群结构在丰度上改变,且梭杆菌属(F u s o b a c t e r i-u m)、纤毛菌属(L e p t o t r i c h i a)和消化链球菌属等与I OH明确相关的菌属比例明显增高,而C组均未见定植,见表2。同时,H组大鼠定植6周与初始口腔菌群相比,卟啉单胞菌属(P o r p h y r o m o n a s)、梭杆菌属、孪生球菌属(G e m e l l a)、纤毛菌属和消化链球菌属等与I OH相关菌属明确定植,而C组未见定植,见表3。I OH患 者 唾 液 整 体 微 生 物 定 植6周 后W i s t a r大鼠口腔菌群变化与临床患者类似,均发现产臭菌的明显定植,说明此模型很好的模拟了I OH口腔微生物的特点。表1 两组大鼠初始口腔菌群差异T a b.1 D i f f e r e n c e s i n t h e i n i t i a l o r a l f l o r a o f t w o g r o u p s o f r a t sxs菌属H组C组Z值P值链球菌属0.3 3 6 8 00.2 7 6 1 90.3 5 0 8 50.2 6 9 8 5-0.2 8 90.7 7 3罗斯氏菌属0.1 7 0 3 60.1 3 3 1 50.1 3 3 9 80.1 2 7 4 3-0.2 8 90.7 7 3凝聚杆菌属0.1 8 7 8 60.1 6 8 7 40.0 9 5 8 40.0 5 9 6 3-0.2 8 90.7 7 3乳杆菌属0.0 4 1 8 60.0 8 0 6 30.0 6 8 8 30.1 0 5 2 4-1.1 5 50.2 4 8韦荣球菌属0.0 1 2 7 50.0 2 5 5 00.0 3 9 9 20.0 4 1 1 6-1.4 7 90.1 3 9异杆菌属0.0 3 3 7 40.0 6 6 8 50.0 0 6 7 40.0 0 7 4 6-0.2 8 90.7 7 3纤维菌属00.0 3 0 0 80.0 6 0 0 7-1.5 1 20.1 3 1棒状杆菌属0.0 1 2 8 70.0 2 1 8 50.0 0 4 8 90.0 0 1 8 6-0.8 6 60.3 8 6普雷沃菌属0.0 0 0 9 60.0 0 1 9 10.0 1 5 3 60.0 2 8 4 3-1.4 7 90.1 3 9罗尔斯通菌属0.0 0 8 2 30.0 1 1 2 10.0 0 5 1 50.0 0 2 8 6-0.2 8 90.7 7 3奈瑟菌属00.0 1 1 2 80.0 2 2 5 6-1.0 0 00.3 1 7放线菌属0.0 0 8 5 20.0 1 5 9 60.0 0 1 6 50.0 0 2 3 201.0 0 0颤螺菌属0.0 0 3 2 00.0 0 6 3 20.0 0 4 4 80.0 0 5 9 5-1.1 6 20.2 4 5 普雷沃氏菌属0.0 0 0 2 10.0 0 0 4 10.0 0 7 4 00.0 1 3 5 5-1.6 9 20.0 9 1梭菌属0.0 0 5 3 40.0 1 0 6 30.0 0 2 2 10.0 0 1 8 8-0.5 9 20.5 5 4阿克曼氏菌属0.0 0 3 3 30.0 0 6 4 50.0 0 4 0 50.0 0 6 8 5-1.1 6 20.2 4 5瘤胃球菌属0.0 0 2 4 20.0 0 4 8 00.0 0 4 1 80.0 0 6 3 4-1.1 6 20.2 4 5费克蓝姆氏菌属0.0 0 3 0 20.0 0 3 2 10.0 0 2 7 30.0 0 2 2 7-0.2 8 90.7 7 3粪球菌属0.0 0 0 8 40.0 0 1 6 90.0 0 3 8 30.0 0 7 3 9-0.6 6 10.5 0 8脱硫弧菌属0.0 0 0 9 10.0 0 1 8 20.0 0 3 5 50.0 0 6 4 4-1.0 7 60.2 8 2747 口腔医学研究2 0 2 3年8月第3 9卷第8期表2 两组大鼠定植6周后口腔菌群差异T a b.2 D i f f e r e n c e s i n o r a l f l o r a b e t w e e n t w o g r o u p s o f r a t s a f t e r 6 w e e k s o f c o l o n i z a t i o nxs菌属H组C组Z值P值链球菌属0.4 8 0 0 0 00.0 7 0 0 0 00.2 8 0 0 0 00.1 4 0 0 0 0-2.0 2 10.0 4 3费克蓝姆氏菌属0.0 0 1 0 0 00.0 0 0 3 0 00.0 2 0 0 0 00.0 2 0 0 0 0-2.3 0 90.0 2 1支原体0.0 0 2 0 0 00.0 0 2 0 0 00.0 0 0 0 9 00.0 0 0 1 0 0-2.0 3 30.0 4 2梭杆菌属0.0 0 2 0 0 00.0 0 2 0 0 00-2.4 6 00.0 1 4纤毛菌属0.0 0 1 0 0 00.0 0 2 0 0 00-1.9 8 40.0 4 7迪茨氏菌属0.0 0 0 2 0 00.0 0 0 1 0 00-1.9 8 40.0 4 7纤维菌属0.0 0 0 0 1 00.0 0 0 0 3 00.0 0 0 2 0 00.0 0 0 0 4 0-2.3 6 60.0 1 8毛绒厌氧杆菌属0.0 0 0 2 0 00.0 0 0 2 0 00-1.9 8 40.0 4 7颗粒链菌属0.0 0 0 0 0 30.0 0 0 0 0 60.0 0 0 1 0 00.0 0 0 1 0 0-2.3 6 60.0 1 8嗜血杆菌属0.0 0 0 1 0 00.0 0 0 0 6 00-2.4 6 00.0 1 4消化链球菌属0.0 0 0 0 8 00.0 0 0 0 5 00-2.4 6 00.0 1 4表3 H组大鼠初始与定植6周后口腔菌群差异T a b.3 D i f f e r e n c e s i n o r a l f l o r a b e t w e e n r a t s i n g r o u p H i n i t i a l l y a n d a f t e r 6 w e e k s o f c o l o n i z a t i o nxs菌属初始定植6周Z值P值孪生球菌属00.0 9 7 1 20.0 4 0 6 3-2.4 6 00.0 1 4异杆菌属0.0 3 3 7 40.0 6 6 8 50.0 0 0 0 40.0 0 0 0 6-2.3 2 30.0 2 0卟啉单胞菌属00.0 2 4 5 20.0 2 8 3 0-2.4 6 00.0 1 4肠球菌属00.0 0 4 9 40.0 0 2 6 5-2.4 6 00.0 1 4支原体00.0 0 2 0 60.0 0 1 8 1-2.4 6 00.0 1 4梭杆菌属00.0 0 1 7 90.0 0 1 9 8-2.4 6 00.0 1 4纤毛菌属00.0 0 1 3 30.0 0 1 7 1-1.9 8 40.0 4 7迪茨氏菌属00.0 0 0 1 70.0 0 0 1 1-1.9 8 40.0 4 7毛绒厌氧杆菌属00.0 0 0 1 50.0 0 0 1 5-1.9 8 40.0 4 7嗜血杆菌属00.0 0 0 1 30.0 0 0 0 6-2.4 6 00.0 1 4消化链球菌属00.0 0 0 0 80.0 0 0 0 5-2.4 6 00.0 1 4杆菌属00.0 0 0 0 70.0 0 0 0 3-2.4 6 00.0 1 42.2 I OH患者唾液整体微生物群定植引起大鼠口腔菌群代谢变化 I OH患者口腔中产臭菌的高丰度定植是目前广为接受的病因,但近年来认为产臭菌的代谢可能是核心因素1 4,1 5。研究表明,特定生态系统中,优势物种的生存依赖于以它们的代谢活动为基础的物种共生代谢网络1 5。然而,产臭菌的代谢容易受到口腔内环境的影响1 6,1 7,这可能是I OH具有波动性的原因之一。硫代谢和某些含硫氨基酸(色氨酸、精氨酸、脯氨酸和赖氨酸等1 3)代谢是 导 致I OH的 主 要 代 谢 通 路。本 研 究 使 用P I C RU S t方法对上述主要代谢途径进行预测分析,H组大鼠定植6周后与C组相比,半胱氨酸和蛋氨酸代 谢、精 氨 酸 和 脯 氨 酸 代 谢 均 表 现 出 高 水 平(表4),而在初始口腔菌群代谢中未发现上述差异(表5)。此部分结果说明,本文所建立的模型能够很好模拟临床患者口腔菌群代谢特点。表4 两组大鼠定植6周后I OH相关代谢途径差异T a b.4 D i f f e r e n c e o f I OH-r e l a t e d m e t a b o l i c p a t h w a y b e t w e e n t w o g r o u p s a f t e r 6 w e e k s o f c o l o n i z a t i o nxs代谢途径H组C组t值P值半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径5 4 8.8 81 3.1 14 6 9.7 43 4.4 54.2 9 40.0 0 5精氨酸和脯氨酸代谢途径2 4 8.2 0 4.9 52 2 9.2 11 1.8 12.9 6 70.0 2 5表5 两组大鼠初始I OH相关代谢途径差异T a b.5 D i f f e r e n c e o f i n i t i a l I OH-r e l a t e d m e t a b o l i c p a t h w a y b e t w e e n t w o g r o u p s o f r a t sxs代谢途径H组C组t值P值半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径4 7 0.4 52 3.5 24 7 8.1 02 8.3 1-0.4 1 60.6 9 2精氨酸和脯氨酸代谢途径2 2 7.8 21 9.8 32 3 2.3 73 5.4 2-0.2 2 40.8 3 0847J o u r n a l o f O r a l S c i e n c e R e s e a r c h,A u g.2 0 2 3,V o l.3 9,N o.8 2.3 I OH患者唾液整体微生物群定植引起大鼠口气值变化 口气检测是目前临床上广泛使用的唯一客观检测方式。其设备主要有H a l i m e t e r口气检测仪和气相色谱仪。两者均可检测V S C s来判断口臭,但口气检测仪不能有效区分V S C s成份且无法检测短链脂肪酸等其他致臭物质1 8;气相色谱仪虽然可以弥补前者的缺陷,但因其可操作性差多应用于科研1 9。因此,结合研究目的和I OH主要病因,本研究采用H a l i m e t e r口气检测仪。两组大鼠初始口气值一致性较好(t=0.8 4 7,P=0.4 1 1),且均处于较低水平。I OH患者唾液整体微生物群在定植2周、4周和6周后,口气检测结果提示H组大鼠口气值逐渐升高且幅度逐渐趋向平缓,而C组大鼠口气值呈现波动式变化,考虑一定程度上可能受环境和饮食影响,见图1。H组定植6周后与初始口气值相比差异显著(t=-9.1 4 4,P0.0 0 0 1),与C组定植6周 后 相 比 仍 明 显 升 高(t=7.8 2 7,P0.0 0 0 1)。此部分实验结果说明,本文所建立的模型可以很好的模拟临床患者的口气特点。图1 两组大鼠口气值变化折线图F i g.1 L i n e c h a r t o f t h e c h a n g e o f b r e a t h v a l u e o f r a t s i n t w o g r o u p s.3 讨论 口腔微生态失衡所致的口臭是一种常见疾病,它影响着我国大约2 7.5%和西方大约5 0%的人口,是口腔科就诊的第三大原因6,2 0。目前,现有的治疗方式效果欠佳且存在不良影响。因此,建立口臭研究动物模型,开发更有效的新兴治疗方式和相关产品非常必要。现阶段,关于I OH的相关研究相对缓慢,其原因主要有两方面:(1)口腔环境相对开放,易受环境和饮食的影响,成为研究中较大的混杂因素;(2)缺少能够完全模拟I OH特征的动物模型。在已报道的研究中,采用的模型主要使用单一产臭菌或已知的多种产臭菌混合物的定植2 1。虽然这种模型有利于研究产臭菌间的相互作用,并且可以通过对某一产臭菌的调控来开发治疗方法,为新的治疗措施提供思路。但受制于目前检测技术,仍有大量微生物群是未知的,这些未知菌群同样在其中发挥着重要作用,而已知产臭菌的模型无法完全模拟菌群间的作用和代谢网络,是目前研究模型中的缺陷,因此构建出更全面的I OH动物模型是未来口臭研究的重点之一。通过临床问诊发现,大多数患者表示高频使用抗菌漱口水和牙齿洁治均可在一定时间内缓解口臭,使心情愉悦。二者均可通过消灭产臭菌、破坏其生存环境和减少其作用底物使口腔菌群结构暂时改变,但随着菌群的平衡恢复口臭仍会复发,这明确了口腔菌群失衡在I OH发生中的关键作用2 2,2 3。但也有研究表明,菌群的代谢和相互作用在I OH中占据着主要地位1 4,1 5。因此,为最大程度保留菌群间的相互作用、代谢网络和结构特点,本文将I OH患者口腔中最具代表性的唾液微生物群整体用于大鼠模型的创建。在模型构建时,本文需要去除大鼠口腔原始微生物群的竞争并最大程度使I OH患者唾液微生物群定植和发挥其致病功能。最常见的抗菌方式有药物口服和局部应用,口服抗菌药是一种全身作用方式,其不仅可消灭抗菌谱内的口腔菌群,对肠道菌群等其他生态位微生物群同样发挥作用,并且药物半衰期还会对成模时间和成模率造成影响。抗菌药物的局部应用虽然可在一定程度上避免药物的全身作用,但受抗菌谱的影响,效果也难以保证。因此,使用了物理和化学相结合的方法最大程度上对大鼠口腔原始菌群进行清除7。此外,使用羧甲基纤维素钠增稠、定植1 h内禁食水和长期高糖饮水等方式创造产臭菌生存环境并增加其口腔停留时间,发挥最大造模效果。排除非口源性口臭和短暂口臭,口腔产臭菌定植增加、代谢变化和口气检测值增高是临床判断口臭常用的方式。本实验结果提示,H组大鼠I OH患者唾液整体微生物群定植6周后口气值较C组和初始值明显增加并逐渐变缓接近峰值,在症状层面上说明模型构建成功。大量研究发现,I OH患者与健康对照者口腔菌群存在显著差异,主要表现在结 构 变