血管紧张素Ⅱ通过下调血管内皮钙粘连蛋白抑制血管内皮细胞中紧密连接蛋白1的表达.pdf
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1、729第 9 期第 53 卷2023-02-22绍兴市科技计划项目(2018C30021);浙江省医药卫生科技计划项目(2016RCA027)。沈红枫,副主任医师,Email:。刘龙斌,主任医师,Email:。收稿日期:基金项目:作者简介:通信作者:血管紧张素II通过下调血管内皮钙粘连蛋白抑制血管内皮细胞中紧密连接蛋白1的表达沈红枫,查渭,金志江,夏海江,刘龙斌绍兴文理学院附属医院绍兴市立医院心血管内科,浙江绍兴312000摘 要 目的:探索血管紧张素I I(Ang I I)引发微血管内皮通透性增加的具体机制。方法:大鼠主动脉内皮细胞原代培养鉴定,取4-7代细胞用于实验,将细胞分为对照组、An
2、g I I组、Ang I I+缬沙坦组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Westernblot)法检测细胞中紧密连接(ZO-1)、血管内皮钙粘连蛋白(VE-cadherin)的表达,免疫荧光染色检测细胞中ZO-1蛋白的分布。通过向内皮细胞转染过表达VE-cadherin质粒,检测过表达VE-cadherin对Ang I I诱导的ZO-1蛋白表达和蛋白分布改变的影响。结果:相比于对照组,Ang I I组内皮细胞ZO-1和VE-cadherin在mRNA和蛋白水平的表达均显著减少(P0.01),且ZO-1蛋白在细胞周边分布的趋势显著降低。在Ang I I干预的内皮细胞中
3、过表达VE-cadherin后,内皮细胞ZO-1蛋白表达增加(P0.01),细胞周边分布趋势显著增强。结论:Ang I I通过下调VE-cadherin抑制血管内皮细胞中ZO-1蛋白的表达,从而破坏内皮细胞间的紧密连接,这可能是Ang I I引发微血管通透性增加的具体机制。关键词 血管内皮细胞;血管紧张素I I;血管内皮钙粘连蛋白;紧密连接;血管通透性中图分类号R543 DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2023.09.006Angiotensin II inhibits ZO-1 expression in endothelial cells by down-regu
4、lating VE-cadherin SHEN Hongfeng,CHAWei,JINZhijiang,XIAHaijiang,LIULongbin.DepartmentofCardiology,theAffiliatedHospitalofShaoxingUniversity,ShaoxingMunicipalHospital,Shaoxing312000,China Abstract:Objective:To explore the mechanism by which angiotensin(Ang II)disrupts microvascular permeability.Metho
5、ds:The primary culture and identification of rat endothelial cells were conducted,and cells in passage 4-7 used for the experiment were divided as the control,Ang II and Ang II+valsartan groups;real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR)and Western blot were used to test the expression
6、 of zonula occludens-1(ZO-1)and vascular endothelial(VE)-cadherin in the cells;the distribution of ZO-1 protein was detected by immunofluorescence assay.After transfection of VE-cadherin into endothelial cells,the cells were divided as the control,Ang II and Ang II+VE-cadherin groups.The expression
7、and distribution of ZO-1 protein were also detected.Results:Compared with the control group,the expression of ZO-1 and VE-cadherin in Ang II group was significantly decreased in mRNA level and protein level(both P0.01).Additionally,the peripheral positioning of ZO-1 protein in cell membrane was rema
8、rkably depressed.However,over-expression of VE-cadherin by transfecting over-expression plasmid could significantly reverse the expression and distribution of ZO-1 in Ang II-treated endothelial cells.Conclusion:Ang II inhibited the expression of ZO-1 protein in vascular endothelial cells by down-reg
9、ulating VE-cadherin,thus destroying the tight junction between endothelial cells,which may be the possible mechanism by which Ang II disrupts microvascular permeability.Key words:endothelial cells;angiotensin II;vascular endothelial-cadherin;tight junction;vascular permeability本文引用:沈红枫,查渭,金志江,等.血管紧张
10、素II通过下调血管内皮钙粘连蛋白抑制血管内皮细胞 中紧密连接蛋白1的表达J.温州医科大学学报,2023,53(9):729-733.论 著血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosteronesystem,RAAS)重要的效应分子之一,可调节多种细胞因子的表达,在生理条件下维持心Vol.53 No.9Sep.2023第53卷第9期2023年9月温 州 医 科 大 学 学 报Journal of Wenzhou Medical University730第 53 卷温 州 医 科 大 学 学 报第 9
11、 期血管系统的内稳态,在调控血管内皮细胞功能状态中具有重要的作用1。在病理条件下,Ang II通过激活多条信号通路来参与血管内膜增生、心肌肥大、心脏重塑等心血管疾病的发生与发展,而使用血管紧张素受体抑制剂(如缬沙坦)能显著延缓上述病理过程2。研究3显示Ang II可以通过引发微血管通透性增加,从而参与多种心血管疾病的进展,但是其破环微血管的具体机制目前尚未阐明。血管内皮细胞屏障的完整性是维持正常血管通透性的基础。血管内皮细胞之间存在着许多紧密连接。这些紧密连接常围绕细胞的顶端并呈连续带状,使相邻的内皮细胞紧密连接在一起,填充细胞间隙,形成一道天然的物理屏障,起着维持细胞内环境稳态、选择性通透等
12、细胞基本功能的作用4。紧密连接相关跨膜蛋白(zonulaoccludens-1,ZO-1)是细胞间紧密连接的主要成分,其在内皮细胞中的表达和分布对内皮细胞紧密连接的功能具有决定性的作用5。孙瑞等6发现通过微小RNA干预内皮细胞进而调控其ZO-1蛋白的表达升高,能有效抑制缺氧导致的血管通透性增高。同时,有研究7表明雷公藤内酯干预在增加ZO-1蛋白表达的同时可以提高结肠内膜的紧密连接数量。本研究拟通过细胞实验检测Ang I I对内皮细胞中ZO-1表达及分布的影响,以及血管内皮钙粘连蛋白(vascularendothelial-cadherin,VE-cadherin)在其中的作用,以期探究Ang
13、I I破环微血管内皮细胞屏障的可能机制。1 材料和方法1.1 材料 M199培养液、胰蛋白酶购自美国Sigma公司;胎牛血清购自美国GIBCO公司;RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司;Takara反转录试剂盒购自大连宝生物公司;SYBRGreen荧光染料试剂盒购自美国Roche公司;兔或鼠抗人ZO-1、VE-cadherin、-actin多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的二抗购自美国ABCAM公司;脂质体2000购自美国Invitrogen公司;蛋白质印迹(Westernblot)相关试剂购自上海碧云天生物技术有限公司;VE-cadherin过表达质粒由上海吉玛制药技术有限公司设计合成
14、。1.2 方法1.2.1 细胞培养和分组:大鼠主动脉内皮细胞通过I型胶原酶酶消化法分离获得,并在含20%胎牛血清的内皮细胞培养基中继续培养8。细胞分为对照组、Ang II组、Ang II+缬沙坦组以验证Ang II对细胞通透性的影响。根据是否使用Ang II和VE-cardherin过表达干预内皮细胞,分别设置对照组、Ang I I组和Ang I I+VE-cadherin过表达组,并予以对应干预。1.2.2 细胞转染:将内皮细胞系接种至6孔板,生长至50%70%密度时,以脂质体2000分别转染VE-cadherin过表达质粒或空质粒各100pmol,24h后提取总RNA/蛋白后,实时荧光定量
15、聚合酶链反应(real-timequantitativepolymerasechain reaction,RT-qPCR)鉴定转染效率,进行后续实验。1.2.3 RT-qPCR检测基因表达:提取内皮细胞中总RNA,将提取的RNA反转录成cDNA,反应体系为20L,反应条件为:37、15min反转录,85、5s反转录酶失活,4保存。运用SYBRGreen法检测ZO-1mRNA、VE-cadherinmRNA的表达情况,反应条件为:94、15min预变性,94、30s变性,60、30s退火,72、30s延伸,共循环40次。每组样品重复3次,实验重复3次。1.2.4 Westernblot法检测蛋白
16、表达量:提取各组细胞中的总蛋白,用BCA法定量蛋白,SDS-PAGE胶每孔加入20L的样品,75V、30min进行蛋白浓缩,110V、2h进行蛋白电泳,并用孔径0.45m的PVDF膜240mA、90min进行转膜。转膜后常温下TBST洗膜3次、封闭1h后,以1:1 000浓度加入兔(鼠)抗人ZO-1一抗(或抗VE-cadherin、-actin一抗),4孵育过夜,常温下TBST洗膜3次,辣根过氧化物酶标记羊抗兔(鼠)二抗孵育后ECL化学发光法检测。柯达胶片暗室显影,QuantityOne软件分析。1.2.5 细胞免疫荧光法检测ZO-1在细胞中的分布及表达:各组细胞干预结束后,PBS洗3遍,用4
17、%多聚甲醛固定,0.25%TritonX100穿破细胞膜,山羊血清室温封闭1h,加入稀释了250倍的ZO-1抗体,4过夜,PBST清洗3遍,加入结合有FICT的山羊抗兔二抗,室温孵育1h,PBST清洗3遍,荧光显微镜拍照后图片用Imageproplus6.0分析。1.3 统计学处理方法 采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量资料用 s表示,多组间均数比较用单因素方差分析,组间两两比较用LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 Ang I I抑制内皮细胞中ZO-1表达水平和细胞膜分布 相比于对照组,Ang II组ZO-1的mRNA和蛋白731第 9 期第 53 卷表达量
18、均显著降低(P0.01),且ZO-1蛋白在细胞膜上表达趋势减弱;与Ang II组比,Ang II+缬沙坦组内皮细胞ZO-1mRNA和蛋白表达量显著增加(P0.01),且ZO-1蛋白在细胞膜上的表达恢复,见图1。2.2 Ang II对内皮细胞中VE-cadherin表达的影响 与对照组比较,Ang I I组中VE-cadherin蛋白的表达减少(P0.01),VE-cadherinmRNA的表达也减少(P0.01);相比于Ang II组,Ang II+缬沙坦组内皮细胞中VE-cadherin表达增加(P0.01),见图2。2.3 VE-cadherin过表达质粒逆转成功 脂质体2000分别转染V
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