山西中药大枣的嫩叶总DNA提取方法的研究.pdf
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1、山西卫生健康职业学院学报2023 年 第 33 卷 第 2 期Journal of Shanxi Health Vocational College 灾ol.33 No.2 2023咱作者简介暂 张琰,女,讲师,从事生物制药、天然产物化学教科研工作我国枣树种质资源极为丰富,中国果树志枣卷 中记载的枣树品种就有 700 多个。之前我国学者在枣树栽培、良种选育、快速繁殖方面研究较多,但是如何将繁多的品种进行鉴别分类以便种质更好的保存是当前枣树种质资源研究的重点。近十几年来国内外迅速发展起来的分子标记技术如 AFLP 技术(扩增片段长度多态性)是枣树品种鉴定的有效方法,既具有 PCR 的高效性、安全
2、型和方便性的特点,又具有 RFLP 可靠性好,重复性高的优点,被广泛用于植物科学研究的各个方面咱1暂。不同的DNA 提取技术对 AFLP 的试验影响非常大,本文对枣树叶片DNA 的提取进行了试验研究,旨在为后续枣树叶片 AFLP 体系的建立做好准备,同时也为枣树资源品种分类、鉴别奠定基础。1材料与方法1.1材料植物:试验所用材料为交城骏枣幼嫩叶片、太谷壶瓶枣幼嫩叶片、运城梨枣幼嫩叶片,均采自于山西临猗枣树研究所。叶片采集后立即放置于密封袋中,用冰盒带回实验室。然后置于冰箱冷冻室-80保存。主要仪器:台式高速离心机:TGL-16G 型(上海医用分析仪器厂);电泳仪:HV-3000 型高压稳压电泳
3、仪(北京东方仪器厂);干燥箱:熊猫牌 DGF20 型电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂);凝胶成像系统:TMW-20Transilluminator(美国,DELL);DNA 混合仪(宁波新芝科器研究所);TU-1810 紫外可见分光光度计;移液枪、恒温水浴锅等。试剂:昆明晨致远绿有限公司生产的快捷型植物基因组DNA 提取系统试剂盒、氯仿溶液、异戊醇溶液、异丙醇、RNase、CTAB 缓冲液、3.5mol/L 的 NaAc 溶液、70%乙醇、无水乙醇等。1.2方法常规 CTAB 法取 1g 枣幼嫩叶片,于液氮中研成粉。将枣叶冻粉转入到预冷离心管中,立即加入等体积(w/v)2CTAB 提取缓冲液,6
4、5保温 1020min,其间不时摇晃。加入等体积的氯仿异戊醇,轻缓颠倒离心管进行混匀,室温下,12 000r/min 离心 1020min。将上清液转入另一离心管中,加入等体积的氯仿-异戊醇,颠倒离心管混匀,于室温在 12000r/min 离心 10min。将上层水相转入新的经硅烷化处理的离心管中,加入 0.6 倍-1 倍体积的异丙醇,混匀,室温下放置约30min。3 5004 000r/min 离心 510min,去上清液,70%乙醇漂洗,沉淀吹干。风干后加入适量蒸馏水溶解 DNA。待 DNA 完全溶解后,加入 12LRNase(10mg/mL),于 37保温 1h 以去除 DNA 中的 R
5、NA。4保存备用。取 2LDNA 溶液电泳检测。改良 CTAB 法:在参考陈娟等改良 CTAB 法的基础上稍作改进以适合红枣叶片 DNA 提取的要求,即是在 2%CTAB提取液中加入 2%抗氧剂-巯基乙醇和 2%螯合剂 PVP40,排除酚类物质和色素的干扰咱2暂。在用酚-氯仿抽提 DNA 时在去除 RNA 的时候加入 1/10 体积的 3.5mol/L 的 NaAc,再加入无水乙醇沉淀 DNA 去除多糖。试剂盒法:称取 100mg 枣叶片干材料,加入少量石英砂研磨成细粉末状,将枣叶片粉末装到 2.0mL 的离心管中。采用快捷型植物基因组 DNA 提取系统试剂盒,再严格按照试剂盒的操作说明进行
6、DNA 的提取。1.3DNA 检测方法紫外分光光度计检测:取出 2L DNA 溶液,用紫外可见分光光度计分别测定 OD260/OD280、OD260/OD230、DNA 浓度,重复 3 次,取平均值。琼脂糖凝胶电泳检测:取 1L DNA 提取样品和 2L 上样缓冲液(0.25%溴酚蓝+40%蔗糖),混匀后点入胶孔,标准分子量为稀释的 200ngDNAladder。输出电压 90V,恒压电泳 2030min。电泳完毕后,将凝胶从电泳槽中取出,凝胶成像系统观察拍照。2结果2.1紫外分光光度计 DNA 检测通过常规 CTAB 法、改良 CTAB 法、试剂盒法抽提枣嫩叶总 DNA,试验结果表明,3 种
7、方法均能有效抽提枣叶片总 DNA,但在 DNA 的提取浓度和纯度上有所差异。高纯度 DNA 的OD260/OD280 值应在 1.82.0 之间。当 OD260/OD280 小于 1.8时,DNA 样品中可能存在蛋白质污染;当 OD260/OD280 大于2.0 时,DNA 样品中 RNA 含量较高咱3暂。当 OD260/OD230 的数值大于 2.0 且小于 2.4,表明小分子盐离子、色素、多糖或醇等杂质含量较少,在此范围之外说明有污染,一般小于 2.0 说明有胍基或巯基乙醇残留咱4暂。本试验采用常规 CTAB 法、改良 CTAB 法、试剂盒法抽提 DNA 的 OD260/OD280 值分别
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