熟地黄蒸制过程特征图谱和颜色变化研究及炮制工艺优选.pdf
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1、熟地黄蒸制过程特征图谱和颜色变化研究及炮制工艺优选刘燎原,纪玉华,王文丽,甘力帆,黄瑶,曾昭君,张志鹏(广东一方制药有限公司,广东省中药配方颗粒企业重点实验室,广东 佛山 528244)摘要:目的 研究熟地黄蒸制过程中特征图谱与颜色的变化规律,结合 Box-Behnken 响应曲面模型,优选熟地黄炮制工艺。方法 应用 Pearson 相关性分析、聚类分析、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)等多元统计方法研究熟地黄蒸制过程中的颜色和特征图谱峰面积变化,筛选熟地黄药材关键的质量标志物(Q-markers),以 Q-markers 为评价指标,结合综合评分法考察蒸制时间、干燥
2、温度、干燥时间对熟地黄质量的影响,同时采用 Box-Behnken 响应曲面法优选最佳炮制工艺。结果 建立的生地黄特征图谱和熟地黄特征图谱分别标定 18、20 个共有峰,其中 19 号峰5-羟甲基糠醛(5-HMF)为生地黄经炮制后产生的新化学成分;生地黄蒸制 2 h 后色差显著(E12),且各特征峰峰面积与生品的差异较大;蒸制时间超过 2 h后,不同蒸制时间点的熟地黄 E为 0.284.76,色差不能被肉眼识别。以色度值 L、a、b、E为变量可将不同炮制点的熟地黄聚为 3 类,以色度值 L、a、b、E,环烯醚萜苷类成分,苯乙醇苷类成分,5-HMF 为变量可将不同炮制点的熟地黄聚为 4 类。熟地
3、黄最佳炮制工艺为:润制水量为药材量的 0.3 倍,润制时间为 24 h,蒸制时间为 2.17 h,干燥温度为 61.15,干燥时间为 13.73 h。结论 建立的响应面模型准确、可预测,建立的特征图谱方法和优选的熟地黄炮制工艺方法稳定可行,结合炮制过程的颜色变化规律,可为熟地黄的质量控制和综合开发利用提供参考。关键词:地黄;熟地黄;特征图谱;炮制;色度值;响应曲面法中图分类号:R284文献标志码:A文章编号:1672-0482(2023)08-0764-11DOI:10.14148/j.issn.1672-0482.2023.0764引文格式:刘燎原,纪玉华,王文丽,等.熟地黄蒸制过程特征图谱
4、和颜色变化研究及炮制工艺优选J.南京中医药大学学报,2023,39(8):764-774.Study on the Characteristic Specturm and Color Change of Steamed Rehmanniae Radix Praeparata and Optimization of Pro-cessing TechnologyLIU Liao-yuan,JI Yu-hua,WANG Wen-li,GAN Li-fan,HUANG Yao,ZENG Zhao-jun,ZHANG Zhi-peng(Guangdong Yifang Pharmaceutical Co
5、.Ltd.,Guangdong Province Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula Granule,Foshan 528244,China)ABSTRACT:OBJECTIVE To optimize the processing technique of Shudihuang(Rehmanniae Radix Praeparata,RRP)by Box-Behnken response surface model based on the change rule of characteristic spectrum
6、and color.METHODSMultivariate statistical methods including Pearson correlation analysis,cluster analysis,principal component analysis(PCA)and orthogonal partial least squares-discriminate analysis(OPLS-DA)were used to analyze the color changes and the peak area changes of the characteristic spectru
7、m in the processing of RRP,and to screen key quality markers(Q-markers)for RRP.Q-markers were used to evaluate the effects of steaming time,drying temperature,and drying time on the quality of RRP,and the Box-Behnken response surface method was used to determine the optimal processing technique.RESU
8、LTS The established characteristic spectrum of Shengdihuang(Reh-manniae Radix,RR)and RRP marked 18 and 20 common peaks,respectively.Among them,peak 19(5-HMF)was a new chemical component produced after the processing of RR.There was a significant difference in color(E 12)after 2 h of evaporation,and
9、the peak area of each characteristic was significantly different from RR.The E of RRP at different steaming time points was 0.284.76,indicating that the color difference could not be recognized by the naked eye.RRP from different processing points could be clus-tered into 3 groups with chromaticity
10、values L,a,b,E as variables,and RRP from different processing points could be clustered into 4 groups with chromaticity values L,a,b,E,and iridoid glycosides,phenylethanolglycosides and 5-HMF as variables.The optimum processing technique of steamed RRP was as follows:moistening water was 0.3 times t
11、he amount of medicinal material,moistening time was 24 h,steaming time was 2.17 h,drying temperature was 61.15,and drying time was 13.73 h.CONCLUSION The established response surface model is accurate and predictable,the established characteristic spec-467南京中医药大学学报 2023 年 8 月第 39 卷第 8 期J Nanjing Uni
12、v Tradit Chin Med Vol.39 No.8 Aug.2023收稿日期:2023-03-28基金项目:中华人民共和国工业和信息化部 2022 年产业技术基础公共服务平台项目(2022-230-221)第一作者:刘燎原,男,副主任中药师,E-mail:99263 通信作者:张志鹏,男,副主任中药师,主要从事中药饮片及配方颗粒质量标准研究,E-mail:zhangzp0909 trum and the optimized processing method of RRP are stable and feasible.Combining with the color change r
13、ule of the processing process,it can provide a reference for comprehensive utilization and the quality control of RRP.KEYWORDS:Rehmanniae Radix;Rehmanniae Radix Praeparata;characteristic spectrum;processing;chromaticity value;response surface method 地黄为玄参科植物地黄 Rehmannia glutinosa Li-bosch 的新鲜或干燥块根1,
14、是“四大怀药”之一,也是临床常用的“生熟异治”的大宗中药材。将地黄缓缓烘焙至约八成干,即为生地黄。生地黄经蒸法或酒炖法炮制成熟地黄后,性味由寒、苦转为温、甘,功效由清转补,有补血滋阴,益精填髓1之功效,是“精血形质中第一纯厚之药”2。现代研究表明,地黄中主要含有环烯醚萜苷类、苯乙醇类、紫罗兰酮类、糖类、核苷类、生物碱类、酚酸类、异黄酮苷类等化合物3。基于药效药性和化学成分可测性的地黄质量标志物(Q-markers)预测分析表明,地黄中的多糖类和环烯醚萜苷类是地黄发挥止血凉血作用的主要物质基础,环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、糖类、核苷类等可作为地黄 Q-markers 选择的参考成分4。生地黄经炮制
15、后,梓醇、地黄苷 D、益母草苷等环烯醚萜苷类成分,毛蕊花糖苷等苯乙醇苷类成分,以及糖水、棉子糖等多糖类成分的含量均有所下降;而焦地黄素 A、焦地黄呋喃等非环烯醚萜苷类成分,果糖、半乳糖、葡萄糖等单糖类成分的含量均明显上升5-9。由此提示生地黄和熟地黄药性药效的差异可能与炮制前后化学成分的变化密切相关。此外,由于熟地黄在炮制过程中发生“美拉德反应”,其外观颜色由黄棕色逐渐转变为乌黑色10。熟地黄色黑,归肝、肾经,用于肝肾阴虚,腰膝酸软,骨蒸潮热,盗汗遗精,内热消渴,眩晕,耳鸣,须发早白等症1。吕思霖10对地黄九蒸九晒过程中的颜色变化进行测量,发现生地黄经过一次蒸制后颜色变化有显著性差异。解杨等1
16、1通过研究炆地黄炮制过程中所含成分与色度值的相关性,可预测色度值与成分含量之间的关系,为炆地黄质量评价体系提供了新方法。可见,药材的外观颜色与其归经和功效、成分息息相关,故以颜色作为药材质量的评价指标,符合中医用药理论。基于此,本研究拟通过建立熟地黄炮制过程中特征图谱和考察外观颜色的变化规律,筛选熟地黄药材关键的 Q-markers,同时结合 Box-Behnken 响应曲面法优选清蒸熟地黄的炮制工艺,以期为熟地黄的综合质量评价及工业炮制提供参考。1 材料1.1 仪器H-class 型超高效液相色谱仪(美国 Waters 公司);TS7700 型分光测色仪(深圳市三恩时科技有限公司);ME20
17、4E 型万分之一电子分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司);XP26 型百万分之一电子分析天平(瑞士 Mettler Toledo 公司);KQ-500DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Milli-Q-Direc 型超纯水系统(德国 Merck 公司)。1.2 试剂对照品腺苷(批号:110879-201703)、梓醇(批号:110808-202112)、5-羟甲基糠醛(5-HMF)(批号:111626-202215)、毛蕊花糖苷(批号:111530-201914),质量分数均大于 95%,购自中国食品药品检定研究院;地黄苷 D(批号:wkq21020303)、异毛
18、蕊花糖苷(批号:wkq20050603),质量分数均大于96%,购自四川省维克奇生物科技有限公司;益母草苷(批号:ST20122301),质量分数 99%,购自上海诗丹德标准技术服务有限公司;洋地黄叶苷 C(批号:DST201109-057),焦 地 黄 苯 乙 醇 苷 B1(批 号:DST201203-071),质量分数均大于 95%,购自乐美天医药公司;地黄苷 A(批号:CF202001)、焦地黄苯乙醇苷 A1(批号:CF202002),质量分数均大于97%,购自 Chem Faces 公司。甲醇(分析纯,天津富宇精细化工有限公司),甲醇、乙腈(色谱纯,MERCK公司),磷酸(色谱纯,佛山
19、西陇化学有限公司),超纯水(取自实验室 Milli-Q 超纯水系统)。1.3 药材14 批生地黄药材(编号 D1 D14)经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定均为玄参科植物地黄 Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根。编号 D1 D4、D6、D7、D12 的生地黄产地为河南焦作,D5、D8D10 产地为山西运城,D11 产地为四川广元,D13 产地为陕西宝鸡,D14 产地为陕西西安。14 批生地黄对应的炮制品熟地黄编号为 SD1 SD14。2 方法与结果2.1 熟地黄的炮制取生地黄药材(编号 D1 D14),照中华人民567刘燎原,等:熟地黄蒸制过程特征图谱和
20、颜色变化研究及炮制工艺优选 第 8 期共和国药典2020 年版四部蒸法(通则 0213)12蒸制 4 h,取出,晒至约八成干时,切厚片,于60 下干燥 16 h,即得对应的熟地黄饮片(编号 SD1SD14)。2.2 特征图谱的建立2.2.1 色谱条件 色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm100 mm,1.8 m);流动相:乙腈(A)-体积分数为 0.1%的磷酸水溶液(B)。梯度洗脱程序(体积分数):0 5 min,0%A;5 14 min,0%16%A;14 21 min,16%22%A;21 28 min,22%35%A;2834 min,35%100
21、%A;3436 min,100%0%A。流速:0.3 mLmin-1;检测波长:203 nm(0 7 min,9.5 36 min)、280 nm(7 9.5 min);进样量:1 L;柱温:35。2.2.2 对照品溶液的制备分别取腺苷、梓醇、地黄苷 D、地黄苷 A、益母草苷对照品适量,精密称定,加 10%甲醇溶解制成质量浓度分别为 10、94、64、54、81 gmL-1的混合对照品溶液;取 5-HMF、洋地黄叶苷 C、焦地黄苯乙醇苷 A1、焦地黄苯乙醇苷B1、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品适量,加甲醇溶解 制 成 质 量 浓 度 分 别 为 10、24、24、8、14、4 gmL-1的混合
22、对照品溶液。2.2.3 供试品溶液的制备取生地黄(或熟地黄)粗粉约 0.5 g,精密称定,精密加入 30%甲醇 20 mL,称定质量,超声处理(功率 250 W,频率 40 kHz)30 min,放冷,用 30%甲醇补足减失的质量,摇匀,过0.22 m 微孔滤膜,即得。2.2.4精密度试验取熟地黄供试品(SD1),按“2.2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项色谱条件连续进样 6 次,以 7 号峰(地黄苷 D)作为参照峰(S)计算各共有峰相对保留时间 RSD 为 0.03%0.21%,相对峰面积 RSD 为 0.69%3.28%,表明仪器精密度良好。2.2.5稳定性试验取熟地黄供试品
23、(SD1),按“2.2.3”项方法制备供试品溶液,分别在放置 0、2、4、8、16、24 h 后按“2.2.1”项色谱条件进样分析,以7 号峰(地黄苷 D)作为参照峰(S)计算各共有峰相对保留时间 RSD 为 0.13%1.07%,相对峰面积RSD 为 0.24%4.61%,表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。2.2.6重复性试验取熟地黄供试品(SD1),按“2.2.3”项方法平行制备供试品溶液 6 份,按“2.2.1”项色谱条件进样分析,以 7 号峰(地黄苷D)作为参照峰(S)计算各共有峰相对保留时间 RSD为 0.05%0.32%,相对峰面积 RSD 为 0.88%4.53%,表明该
24、特征图谱方法重复性较好。2.2.7 生地黄、熟地黄特征图谱的建立取 14 批生地黄、熟地黄供试品,分别按“2.2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项色谱条件进样分析,采用软件中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)自动匹配数据,建立 14 批生地黄、熟地黄的特征图谱及对照特征图谱(R)。14 批生地黄特征图谱共标定 18 个共有峰,熟地黄特征图谱共标定 20个共有峰,经对照品比对后确定 3 号峰为腺苷,4 号峰为梓醇,7 号峰为地黄苷 D,8 号峰为地黄苷 A,9号峰为益母草苷,11 号峰为洋地黄叶苷 C,12 号峰为焦地黄苯乙醇苷 A1,13 号峰为毛蕊花糖苷,14 号峰为焦地
25、黄苯乙醇苷 B1,15 号峰为异毛蕊花糖苷,19 号峰为 5-HMF。由结果可知,熟地黄特征图谱中 19 号峰(5-HMF)、20 号峰为生地黄药材经炮制后产生的新特征峰。14 批生地黄、熟地黄的叠加特征图谱及对照图谱 R、混合对照品图谱见图 1。667南京中医药大学学报 2023 年 8 月第 39 卷第 8 期注:3.腺苷;4.梓醇;7.地黄苷 D;8.地黄苷 A;9.益母草苷;11.洋地黄叶苷 C;12.焦地黄苯乙醇苷 A1;13.毛蕊花糖苷;14.焦地黄苯乙醇苷 B1;15.异毛蕊花糖苷;19.5-HMF图 1 14 批生地黄(A)、熟地黄(B)的叠加特征图谱及其对照特征图谱(R)、混
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