利用CRISPR_Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病病毒UL21基因缺失重组病毒.pdf
《利用CRISPR_Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病病毒UL21基因缺失重组病毒.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《利用CRISPR_Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病病毒UL21基因缺失重组病毒.pdf(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、AnimalHusbandry&VeterinaryVeoicine(6):10 1-10 7.MA Z C,LIU X,BAI J,et al.Construction of recombinant pseudorabies virus with UL21genedeletionusingtheCRISPR/Cas9gene-editingtechnologyJ101-107.马梓承,刘星,白娟,等.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病病毒UL21基因缺失重组病毒J.畜牧与兽医,2 0 2 3,55(6):10120233年第6 期第55卷畜牧与兽医利用 CRISPR/Cas9
2、 基因编辑技术构建伪狂犬病病毒UL21 基因缺失重组病毒马梓承,刘星*,白娟,高雁,姜平(南京农业大学/农业农村部动物细菌学重点实验室,江苏南京210095)摘要:旨在构建伪狂犬病病毒(PRV)U L2 1基因缺失重组病毒。采用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白系统9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术,设计针对UL21的单导向RNA(s g RNA),并构建UL21基因左右两侧同源臂质粒(pUC19UL21-Left-Right-CFP),将其与PRV基因组共转染HEK-293T细胞,通过蚀斑纯化获得PRV-U L2 1病毒,并通过PCR和Westernblot检测方法鉴定该毒株成功缺失
3、了UL21基因。结果表明,CRISPR/Cas9技术可用于构建PRV基因缺失重组病毒,为PRV致病机制研究提供重要依据。关键词:伪狂犬病病毒;UL21;CRISPR/Ca s 9;基因缺失中图分类号:S852.65文献标志码:A文章编号:0 52 9-5130(2 0 2 3)0 6-0 10 1-0 7Construction of recombinant pseudorabies virus with UL21 gene deletion usingthe CRISPR/Cas9 gene-editing technologyMA Zicheng,LIU Xing*,BAI Juan,GA
4、O Yanni,JIANG Ping(Nanjing Agriculture University/Key Laboratory of Animal Bacteriology,Ministry of Agricultureand Rural Affairs,Nanjing 210095,China)Abstract:In order to construct a UL21 gene deletion recombinant virus of PRV,the CRISPR/Cas9 genome editing technology was usedhere to design an sgRNA
5、 targeting UL21,and a Left&Right homologous arms plasmid of the UL21 gene(pUC19 UL21-left-right-GFP)were constructed.Then,the above-mentioned plasmid and the PRV genome DNA were co-transfected into HEK-293T cells.The recombi-nant PRV with UL21 gene deletion(PRV-U L2 1)w a s o b t a i n e d b y p l a
6、 q u e p u r i f i c a t i o n,w h i c h w a s a l s o c o n f i r me d b y PCR a n d W e s t e r nblot.The results indicated that the CRISPR/Cas9 technology could be used to construct recombinant pseudorabies viruses with deletions of theviral gene.This study laid an important foundation for future
7、 research on the pathogenic mechanism of PRV.Keywords:pseudorabies virus;UL21;CRISPR/Cas9;gene deletionCRISPR/Cas9是继锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术,具有基因编辑和基因修饰效率高、操作简便及成本低廉等优点,可用于基因敲除、基因敲入、基因抑制、基因激活、多重编辑和功能基因组筛选等,成为当今主流的基因编辑系统 1-3O收稿日期:2 0 2 3-0 2-0 8;修回日期:2 0 2 3-0 4-10基金项目:国家自然科
8、学基金项目(32 2 7 2 98 5);国家现代农业产业技术体系专项(CARS-35)第一作者:马梓承,男,博士研究生*通信作者:姜平,教授,主要从事动物传染病学的教学与研究工作,E-mail;j i a n g p n j a u.e d u.c n;刘星,副教授,主要从事动物病毒免疫与致病机制研究工作,E-mail:x i n g l i u n j a u.e d u.c n。伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是危害我国养猪业重要病原,可引起妊娠母猪流产、死胎,公猪不育,仔猪共济失调及死亡 4-5。2 0 11 年我国PRV毒株出现基因变异,毒力增强 6-7
9、。我国学者利用基因编辑技术构建的gl、g E 和TK 基因缺失疫苗,具有较好免疫保护效力 8-9。本研究在发现PRVUL21基因免疫抑制功能基础上,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功拯救了UL21缺失的重组PRV,为该病毒致病机制研究奠定了重要基础。1材料与方法1.1细胞与毒株HEK-293T、PK-15、V e r o 细胞,本实验室保存;PRVZJO1毒株未(GenBank:K M 0 6 138 1.1),由102AnimalHusbandry&VeterinaryMedicineNo.6Vol.552023本实验室分离保存 7 1.2主要试剂PrimeSTAR Mix、D L2
10、 0 0 0 D NA M a r k e r、D L50 0 0DNAMarker购自TaKaRa公司;双荧光素酶报告系统检测试剂购自Promega公司;DNA提取试剂盒购自Omega公司;LipofectamineTM3000、限制性内切酶Hind、Ba m H I、K p n I、Ec o RI、Bp i I 购自Thermo公司;Taq酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Vazyme公司;低熔点琼脂糖购自BIO-RAD公司;质粒pUC19、PX335购自Addgene公司;感受态细胞购买于TransGene公司;鼠抗UL21蛋白抗体,本实验室制备;Flag抗体、HRP标记羊抗鼠IgG购
11、自Proteintech公司。1.3主要仪器设备普通PCR仪购自Eppendorf公司,凝胶电泳成像系统和免疫印迹法成像系统均购自Tanon公司,荧光显微镜购自Zeiss公司1.4抑制干扰素-(I FN-)启动子活性的PRV毒力蛋白筛选将HEK-293T细胞接种于2 4孔板,培养至细胞密度达到7 5%,采用LipofectamineTM3000转染试剂,按说明书方法转染如下质粒或DNA:50 n g p G L3-Basic-IFN-(IFN-启动子荧光素酶报告质粒),10ngpRL-TK(海肾荧光素酶内参对照质粒),500ngpCMV-cGAS和50 ngpCMV-STING表达质粒(刺激c
12、GAS和STING干扰素通路分子),PRV真核表达质粒(UL13、U L16、U L2 1、U L2 3、U L41、UL47、U L48、U L49、U L50、U L56、EPO、U S3克隆至pCDH)。转染2 4h后,加人细胞裂解液收集细胞,根据说明书测定荧光素酶活性。LARII用于测定荧光素酶活性,Stop&Glo?Reagent用于测定海肾荧光素酶活性,读取OD值,计算相对荧光素酶活性(目的基因启动子活性与内参荧光素酶活性的比值),比较不同转染组IFN-启动子活性差异1.5PRVUL21基因缺失重组病毒的构建1.5.1SgRNA和PCR引物设计与合成在sgRNA设计网站(https
13、:/zlab.bio/guide-design-resources)中输人ZJ01毒株的UL21基因编码区,选择2 对sgRNA引物,在金斯瑞生物科技公司合成其正义链及反义链10 。序列如表1所示。根据PRVUL21基因序列位置前后8 0 0 bp左右用于扩增UL21左侧同源臂(UL21-L)及右侧同源臂(UL21-R),参照pUC19载体的多克隆位点区,利用分子生物学软件PrimerPremier5.0设计UL21左、右同源臂特异性扩增引物(表1)。左臂上游引物酶切位点为Hind,下游引物酶切位点为BamHI;右臂上游引物酶切位点为KpnI,下游引物酶切位点为EcoRI。替换UL21基因的绿
14、色荧光蛋白(CFP)同源臂由CFP表达质粒扩增表1sgRNA和PCR引物序列用途引物名称序列(5 3)长度/bpUL21-sgRNA1_FCACCGGGCGGTCATGATGAGCGACGUL21-sgRNA1_RAAACCGTCGCTCATCATGACCGCCCSgRNA引物UL21-sgRNA2_FCACCGCCTGGTGCACGATCGTGCTC577UL21-sgRNA2_RAAACGAGCACGATCGTGCACCAGGCPX335-sgRNA_RCCATCGCTGCACAAAATAATTAAUL21-L_FTCTAAGCTTGACGGCGGTCCGGCGGCGTTTCGGC838U
15、L21-L_RTATGGATCCACAAATCACACGTCCGTTCTCCCGTUL21-R_FTATGGTACCGGCGGCGGACACACGCGGCGCGGCA840UL21-R_RTATGAATTCAGGTGCCGAGCAGCGCGTCGAACTCUL21-GFP_FGAACGGACGTGTGATTTGTGGATCCGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGPCR引物1300UL21-GFP_RGCCGCGTGTGTCCGCCGCCGGTACCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTUL21-FATGGAGTTTGAGTACCAGAGC1 599UL2
16、1-RTTAACGGTTTTTATTGAGGACGATGGAGATgB-FCCCCCACGACCACCTTGCCGAC723gB-RCACCTACGACCACATCCAGGCG1032023年畜牧与兽医第6 期第55卷1.5.2CRISPR/Cas9-SgRNA质粒的构建及验证将靶向UL21基因2 组sgRNA引物(UL21-sgRNA1、U L2 1-s g RNA 2)(表1)分别退火成双链,反应体系:上下游引物各10 mol/L,10 T 4Li g a s eBuffer(NEB)2 L,T 4 PNK(NEB)0.5 L,ddH,0补足2 0 L。退火条件:37 30 min,955
17、min,每分钟降5直至10 质粒构建与鉴定:50 L体系中加人2 gpX335空载体,2 LBpiI酶,10 xBuffer5L,其余用水补足,37 酶切1h。将酶切后的载体和目的基因24连接2 h,最后将连接产物转化到DH5感受态细胞中,涂布氨苄抗性平板,37 培养12 h。挑取平板单克隆菌落,利用PCR检测阳性菌液。以PX335UL21-sgRNA1重组质粒为例,PCR反应体系25L:加人12.5LTaq酶,9.5LddH,0,1LUL21-sgRNA1上游特异性引物,1LPX335下游通用鉴定引物(根据载体序列设计),1L模板(引物序列见表1)。PCR反应条件:95预变性5min;953
18、0 s,6 2 30 s,7 2 40 s,循环35次;最后7 2 延伸5min。若能成功扩增出57 7 bp条带,则证明PX335UL21-sgRNA1重组质粒构建成功。因为上游引物为sgRNA特异性序列,只有当sgRNA克隆人PX335载体后才能扩增出57 7 bp条带,而空载体中不带有sgRNA序列,故无法扩增出指定大小条带。1.5.3UL21基因同源臂重组质粒的构建扩增ZJ01毒株UL21起始密码子序列前8 38 bp,作为UL21左侧同源臂,并通过hind、Ba m H I 酶切位点将其连接到pUC19空载体上,构建pUC19UL21-L重组质粒。同理扩增UL21终止密码子后840b
19、p,用于UL21右侧同源臂扩增,并通过KpnI、EcoRI酶切位点构建pUC19UL21-L-R重组质粒。PCR反应体系如下:12.5LPrimeSTAR,8.5LddH,O,1LDMSO,U L2 1-L上/下游引物各1L(表1),1LPRVDNA。PCR反应条件:98 预变性1s;9 8 10 s,6 2 5s,7 2 30 s,循环35次;最后7 2 延伸5min(U L2 1右臂同理)。最后利用PCR扩增GFP表达基因片段(约1300bp),通过BamHI,K p n I 酶切位点连接到pUC19 UL21-L-R,构建pUC19 UL21-L-R-GFP 重组质粒。PCR反应体系如下
20、:12.5LPrimeSTAR,9.5LddH,0,U L2 1-CFP上/下游引物各1L(表1),1LGFP模板质粒。PCR反应条件:98 预变性1s;9 8 10 s,6 2 5s,7 2 45s,循环35次;最后7 2 延伸5min。1.5.4PRVUL21基因缺失病毒的拯救病毒基因组DNA提取:PRVZJO1毒株接种PK-15细胞,待病变达到7 5%时,加人细胞裂解液 37裂解15min,56 水浴锅孵育3h。具体提取操作方法见【12。提取成功后加入1mL双蒸水,室温溶解2 0 min,-8 0 分装保存。病毒拯救:将HEK-293T细胞接种到6 孔板中,细胞密度达到7 5%时转染如下
21、质粒或DNA:2 ugPRV基因组DNA,PX335U L2 1s g RNA 1/2 质粒各0.5g,p U C19U L2 1-L-R-CFP质粒2 g。于DMEM混合,用LipofectamineTM3000转染试剂转染至细胞中,同时设置只转染PRV基因组DNA的阳性对照孔和空白对照组。转染48 h后,等到细胞出现30%病变后,用荧光显微镜观察;待细胞病变达到50%时收获细胞,冻融2 次,离心收取上清液,-80保存备用。病毒纯化:取上述病毒液进行10 倍倍比稀释,接种于含Vero细胞的6 孔细胞板,孵育1h后,弃掉上清液,加人终浓度为1%FBS的琼脂糖DMEM混合液,37 培养7 2 h
22、。荧光显微镜下观察筛选绿色病毒蚀斑,挑取带有绿色荧光的单个蚀斑接种到2 4孔细胞板,37 培养7 2 h。荧光显微镜下观察筛选绿色病变的单个蚀斑,继续上述方法进行下一轮纯化,直至视野中病变均为绿色蚀斑。以此方法总计纯化5轮,获得PRV-U L2 1。1.6PRV-AUL21病毒鉴定1.6.1PCR 检测 gB 和 UL211基因根据ZJO1毒株序列,设计UL21和gB检测引物(表1),PCR反应为:12.5L Taq酶,8.5LddH,O,1LDMSO,上/下游引物各1L,1LPRVDNA。PCR反应条件:95预变性5min;95 30 s,6 2 30 s,7 2 1 m in 40 s(g
23、 B 50 s),循环35次;最后7 2 延伸5min。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳K(12 0 V),观察特异条带1.6.2Western blot 检测 UL21 基因以感染复数(MOI)为1的病毒接种剂量将野生型PRV、PRV-U L2 1接种到含Vero细胞单层的6 孔细胞板中,同时设立未感染病毒的细胞作为阴性对照。12 h后加人裂解液收集细胞样品。蛋白转印至NC膜后,常温封闭2 h;以鼠源UL21多克隆抗体为一抗,4孵育过夜;以HRP标记羊抗鼠IgG为二抗,常温孵育1h,观察特异条带。1.7病毒生物学特性1.7.1病毒滴度测定按文献13方法,将野生型PRV、PRV-AUL21倍比稀释后
24、接种到含PK-15细胞的96 孔细胞104No.6Vol.552023Animal Husbandry&Veterinary Medicine板中测定病毒滴度,同时设立未感染病毒的细胞作为阴性对照。1.7.2传代稳定性取PRV-U L2 1传代至F5代,使用特异性引物PCR检测UL21和gB基因(表1),判定重组病毒缺失基因遗传稳定性。1.7.3病毒蚀斑试验将PRV-U L2 1及其野生型PRV接种于Vero细胞单层的6 孔细胞板,孵育1h后弃掉病毒液。加人终浓度为1%FBS的琼脂糖DMEM混合液,培养72h。待细胞培养板中出现明显噬斑时,加人结晶紫染液,室温染色12 h,观察蚀斑形态大小。2
25、结果与分析2.1PRVUL21显著抑制IFN-启动子活性为筛选抑制IFN-表达的PRV毒力蛋白,构建UL13、U L16、U L2 1、U L2 3、U L41、U L47、U L48、UL49、U L50、U L56、EPO、U S3真核表达质粒,利用IFN-启动子双荧光报告系统进行了检测,结果显示,UL21显著抑制cGAS-STING刺激的IFN-启动子活性生(图1)。607nsnsnsns*40*20*0质粒eNec?UL13UL16UL48UL49UL50CGAS+STING+kDa1007055Flag403525-actin40与Vec比较,*表示P0.05,*表示P0.05图1P
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 利用 CRISPR_Cas9 基因 编辑 技术 构建 狂犬病 病毒 UL21 缺失 重组
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。