基于响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌C44发酵参数.pdf
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1、山西农业科学 2023,51(9):1088-1097Journal of Shanxi Agricultural Sciences基于响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵参数马红珍 1,闫敏 2,李磊 3,杨治平 2,张家星 2,蒙秋霞 2,史向远 4(1.山西农业大学 资源环境学院,山西 太原 030031;2.山西农业大学 生态环境产业技术研究院,山西 太原 030031;3.山西农业大学 园艺学院,山西 太谷 030801;4.山西农业大学 山西有机旱作农业研究院,山西 太原 030031)摘要:对贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵条件进行优化,可提高其菌落数和抗菌活性,为该菌株工业化生产提
2、供理论依据。以贝莱斯芽孢杆菌 C44为供试菌株,对培养基、氮源、碳源、无机盐、pH、温度、转速、装液量、接种量等因素进行单因素试验,研究其对 C44菌落数和抗菌活性的影响;并以此为基础,以菌落数为考察指标,通过 Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面试验等方法对其进行优化,选出菌落数生长最优发酵条件。单因素试验结果显示,LB培养基上贝莱斯芽孢杆菌 C44的菌落数和抑菌圈直径均最高,且明显高于其他培养基;C44菌落数和抑菌圈直径在以 10 g/L 胰蛋白胨为碳源、10 g/L 酵母提取物为氮源、10 g/L 磷酸氢二钠为无机盐、pH 值为 7.17.4、温度为 30、转速为 1
3、80 r/min、装液量为 100 mL、接种量为 5%的条件下达到最高。Plackett-Burman 试验从 8个影响因素中筛选出对菌落数生长影响极显著的因素为磷酸氢二钠、温度、转速,采用最陡爬坡设计和 Box-Behnken中心组合设计 3因素 3水平试验,得到对菌落数生长和繁殖影响最大的是磷酸氢二钠,其次是转速,温度影响最小。贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵的最佳条件为:胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 10 g/L、磷酸氢二钠 5.6 g/L、pH 值 7.3、温度 28.7、转速 172 r/min、装液量 100 mL、接种量 5%,在此条件下菌落数为 1.281011 cfu/mL
4、,较优化前提高了 10.1倍,同时还增强了抗病活性。关键词:贝莱斯芽孢杆菌;发酵;菌落数;Plackett-Burman;抗菌活性;响应面法中图分类号:TQ920.1 文献标识码:A 文章编号:10022481(2023)09108810Optimization of Fermentation Parameters of Bacillus velezensis C44 Based on Response Surface MethodologyMA Hongzhen1,YAN Min2,LI Lei3,YANG Zhiping2,ZHANG Jiaxing2,MENG Qiuxia2,SHI X
5、iangyuan4(1.College of Resources and Environment,Shanxi Agricultural University,Taiyuan 030031,China;2.Institute of Ecological Environment Industry Technology,Shanxi Agricultural University,Taiyuan 030031,China;3.College of Horticulture,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China;4.Shanxi Inst
6、itute of Organic Drought Farming,Shanxi Agricultural University,Taiyuan 030031,China)Abstract:Optimization of fermentation conditions of Bacillus velezensis C44 can increase its colony number and antibacterial activity,so as to provide a theoretical basis for the industrial production of Bacillus ve
7、lezensis C44.In this study,taking Bacillus velezensis C44 as the test strain,the effects of culture medium type,nitrogen source,carbon source,inorganic salt,pH,temperature,rotation speed,liquid volume,and inoculation size on the colony number and antibacterial activity of C44 were studied with singl
8、e factor test for the factors mentioned above.Using the colony number as the standard of evaluation,the fermentation conditions were then optimized through Plackett-Burman test,path of steepest ascent method and response surface methodology.The results of single factor test showed that the colony nu
9、mber and the inhibition zone diameter(IZD)of C44 grown on Luria-Bertani(LB)medium were the highest,significantly higher than those on other media.Using LB as basal medium,when the carbon source was 10 g/L of tryptone,nitrogen source was 10 g/L of yeast extract,inorganic salt was 10 g/L of disodium h
10、ydrogen phosphate pH was 7.1-7.4,temperature was 30,rotation speed was 180 r/min,liquid volume was 100 mL,and inoculation size was 5%,the colony number and IZD of C44 were the highest.In the Plackett-burman test,disodium doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.09.14收稿日期:2023-01-12基金项目:山西省 1331工程项目(2021
11、1331-15);山西省重点研发计划重点项目(201903D211002);山西省农业科学院农业科技创新工程项目(YGC2019TD07);山西农业大学“特”“优”农业高质量发展科技支撑工程课题(TYGC-37);山西省现代农业产业技术体系建设专项(2021-11)作者简介:马红珍(1994-),女,陕西宝鸡人,助理研究员,硕士,主要从事生物有机肥研发及黄芪根腐病防治研究工作。通信作者:闫敏(1975-),女,河北深州人,副研究员,硕士,主要从事农业微生物、固体废弃物资源化利用、微生物肥料研究工作。1088马红珍等:基于响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵参数hydrogen phospha
12、te,temperature,and rotational speed were identified as the factors that extremely significantly affected the colony number of C44.Path of steepest ascent method and Box-Behnken center combination design were applied to conduct a three-factor three-level test,and it was found that disodium hydrogen p
13、hosphate had the greatest influence on the colony growth and breeding of C44,followed by rotational speed,and temperature had the least influence.The optimal fermentation conditions of B.velezensis C44 were determined as 10 g/L of tryptone,10 g/L of yeast extract,5.6 g/L of disodium hydrogen phospha
14、te,pH 7.3,28.7,172 r/min,100 mL of liquid volume,5%of inoculation size.Under these conditions,the colony number was 1.281011 cfu/mL,which was 10.1 times higher than that before optimization.The optimized fermentation conditions also enhanced the antibacterial activity of C44.Key words:Bacillus velez
15、ensis;fermentation;colony number;Plackett-Burman;antibacterial activity;response surface methodology贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)能够产生多种生物活性物质,具有良好的生物学功能,在促进植物生长和防治植物真菌病害方面具有重要作用。相关研究表明,贝莱斯芽孢杆菌 FKM10 可以通过增加生物量、促进养分吸收、改善土壤肥力、改变土壤微生物群落结构等促进湖北海棠的生长1。多花黄精内生贝莱斯芽孢杆菌 ZJU-3 可产生多种植物激素2,发酵液中的脂肽粗提物能显著抑制尖孢镰刀菌菌丝的生
16、长,抑制率达到 51.6%,展现出较好的促生与抑菌效果。KIM 等3研究证实,贝莱斯 芽 孢 杆 菌 AK-0 对 真 菌 病 原 体 Colletotrichum gloeosporioides YCHH4 的菌丝生长具有较强的抑制作用,在田间条件下可有效防制苹果炭疽病。此外,贝莱斯芽孢杆菌还陆续被证实对黄瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、亚麻炭疽病菌、亚麻枯萎病菌、辣椒疫霉病菌、油茶炭痕病菌及马铃薯立枯病菌均有明显的抑制效果4,是一种极具应用前景的新型生防菌5-7。贝莱斯芽孢杆菌 C44 分离自浑源健康黄芪根际土壤中,对黄芪根腐病的主要致病菌尖孢镰刀菌8有较强的抗菌活性,有较大的应用需求与应用价值
17、。但有关贝莱斯芽孢杆菌的发酵研究尚少,发酵效果较差,要想将贝莱斯芽孢杆菌 C44 广泛生产并应用于环境中还需要对其发酵条件进行进一步优化。发酵培养基成分(碳源、氮源和无机盐等)和培养条件(温度、pH 和转速等)对微生物数量和抗菌活性强弱有很大的影响9-10。目前,在有关微生物发酵培养基与培养条件的优化方法中,报道最多的是采用响应面法。响应面分析法对工艺条件优化效果较好11-13,其中 Plackett-Burman 试验与 Box-Behnken 试验可用来判断试验因素及交互作用对目标响应值影响程度,准确表达因素对响应值的影响。通过中心组合试验,拟合得到二次多项式模型,从试验设计到结果表述,均
18、较为准确14。响应面法对试验设计进行了优化,以科学的方法来布置试验,并对试验结果进行处理,消耗最小的人力、物力,在最少的时间获得更多更好的生产15。因此,响应面法被广泛应用于微生物发酵过程的优化并取得了较好的效果,乔佳慧子等16使用响应面法优化萎缩芽孢杆菌 E20303 发酵培养基,优化后抑菌率由 51.15%提高至 72.51%;郭艳霞17等用响应面法对贝莱斯芽孢杆菌 YB19 产生中性蛋白酶的活力进行了发酵条件优化,使得其菌株产中性蛋白酶活力为 370.03 U/g。本研究将通过单因素试验与响应面法相结合,以微生物数量和抗菌活性物质为参考指标,优化贝莱斯芽孢杆菌 C44 发酵条件,使之高效
19、发酵,增加菌落数,同时增强抗菌活性,还尽可能地缩短贝莱斯芽孢杆菌菌株扩培周期,以期为该生防菌进一步扩大培养提供一定的帮助。1 材料和方法1.1试验材料供试菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)C44 和黄芪根腐病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),均由山西农业大学生态环境产业技术研究院实验室保存。供试基础培养基18有 LB培养基、SOB培养基、YPD培养基、NB培养基、NBG培养基。主要试剂有胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物(生物试剂,北京奥博星生物技术有限责任公司);氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾(分析纯,天津市北辰方正试剂厂);蔗糖、乳糖、葡萄糖(分析纯,
20、天津市科密欧化学试剂有限公司);硫酸铵(分析纯,天津市致远化学试剂有限公司);磷酸氢二钾(分析纯,天津市北辰方正试剂厂);硫酸镁、硫酸锰(分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司);氯化钙(分析纯,天津市兴复科技发展有限公司)。1089山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期1.2试验方法1.2.1菌落数与抗菌活性测定1.2.1.1菌落数测定用菌落计数法19,取贝莱斯芽孢杆菌发酵菌液 1 mL 加入 9 mL 无菌试管水中,充分振摇,梯度稀释到 1.0107倍,然后将 100 L稀释液吸入牛肉膏蛋白胨平板(NA)中,涂匀后在30 C下培养 48 h,对 NA 培养平板上的菌落数进行统计并重复
21、 3次。1.2.1.2 抗 菌 活 性 测 定 用 双 层 平 板 法 进 行 研究20,将发酵好的菌液于 10 000 r/min离心 25 min,取上清液,过滤(0.22 L 滤膜)备用。将琼脂培养基 10 mL 注入培养皿内,放置在水平面上,待其凝固,再取孢子浓度 1.0106 cfu/mL 尖孢镰刀菌菌悬液,在熔化 50 C 左右 PDA 培养基里混合,二者液体之比为 1 10,混合液倒入上述凝固培养皿内5 mL,放在水平台面固化。将无菌牛津杯竖直放置于双层检测平板之上,添加 200 L 的贝莱斯芽孢杆菌待测液进行试验,置于培养箱内,培养 72 h,测抑菌圈的直径并重复 3次。1.2
22、.2培养基与发酵条件优化1.2.2.1基础培养基筛选将活化后的 C44 菌株在 NB 液体培养基中接种,于 30 C、180 r/min 条件下振荡培养 18 h为种子液。基础培养的条件为:转速 180 r/min、培养温度 30、接种量体积比为 3%、装液量体积比为 40%、培养时间 24 h。在 5 种供试基础培养基上,接种上述培养液 3%,按照上述基本培养条件发酵。再取液体发酵液,统计菌落数,检测发酵液抗菌活性,以筛选出最适基础培养基。1.2.2.2发酵培养基组成优化采用 1.2.2.1 发酵培养条件,改变发酵培养基组成,24 h 后按照 1.2.1测定发酵液菌落数和抑菌圈大小,筛选出最
23、佳发酵培养基组成,每个处理重复 3 次,具体培养基组成设定如下。碳源组分和质量浓度:分别用蔗糖(Su)、乳糖(La)、葡萄糖(Gl)、麦芽糖(Ma)、甘露醇(Mn)、可溶性淀粉(Ss)替换 1.2.2.1 优选基础培养基 LB 中的胰蛋白胨(Tr),其他组分不变,筛选出最佳碳源组分。在最佳碳源组分基础上,设置最佳碳源的质量浓度分别为 5、10、15、20 g/L 处理,其他组分不变,筛选出最佳碳源质量浓度。氮源组分和浓度:LB 为基础培养基,分别用尿素(Ur)、牛肉膏(BE)、硫酸铵(AS)、硝酸铵(AN)、麸皮(Br)替换 LB 基础培养基中的酵母提取物(YE),基础培养基中的其他组分不变,
24、筛选出最佳氮源。在最佳氮源基础上,改变培养基中最佳氮源的质量浓度(5、10、15、20 g/L),基础培养基中的其他组分不变,筛选出最佳氮源质量浓度。无机盐组分和质量浓度:LB为基础培养基,分别用氯化钾(PC)、磷酸氢二钾(DH)、磷酸氢二钠(DP)、硫酸镁(MS)、硫酸锰(MG)、氯化钙(CC)替换 LB 基础培养基中的氯化钠(SC),基础培养基中的其他组分不变,筛选出最佳无机盐。在最佳无机盐基础上,改变培养基中最佳无机盐的质量浓度(5、10、15、20 g/L),基础培养基中的其他组分不变,筛选出最佳无机盐质量浓度。1.2.2.3发酵培养条件优化在 1.2.2.2优化的 LB培养基上,改变
25、发酵条件,24 h 后按照 1.2.1 测定发酵液菌落数和抑菌圈大小,筛选出最佳发酵条件,每个处理重复 3次,具体发酵条件设置如下。pH 值:设初始 pH 值为 5、6、7、8、9,复筛 pH 值为 7.1、7.2、7.3、7.4、7.5;培养温度为 25、30、35;转速为 150、180、210 r/min;250 mL 体积装液量为50、100、150、200 mL;接种量为 1%、3%、5%、7%。1.2.3响应面试验1.2.3.1Plackett-Burman 试验为确定影响 C44菌株菌落数较显著的发酵参数,基于单因素试验结果,使用 Design-Expert.V 8.0.6.1
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