基于蛋白组学的鸽蛋蛋清功能特性研究.pdf
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1、农产品质量与安全2023 年第 4 期基于蛋白组学的鸽蛋蛋清功能特性研究龚兰赵航朱磊陈明栾枫婷何涛魏瑞成王冉渊江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所袁 江苏省食品质量安全重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地袁 南京210014冤摘要院 为研究鸽蛋与其他禽蛋蛋清蛋白的差异袁 挖掘鸽蛋蛋清营养功能特性袁 本研究基于 4D非标蛋白质组学定量技术为鸽蛋尧 鸡蛋尧 鸭蛋尧 鹅蛋和鹌鹑蛋 5 种禽蛋蛋清构建蛋白质组学数据库袁 进行差异蛋白筛选和生物信息学分析遥 结果表明袁 经鉴定鸽蛋蛋清有 500 个蛋白及肽段袁 与其他 4 种禽蛋相比袁 44 个显著上调袁 3 个显著下调遥 50左右的差异蛋白存
2、在于胞外区袁 参与酶活性调节尧 生物调控和细胞代谢等生物过程遥 鸽蛋蛋清蛋白富集程度高且有显著性差异的生物过程有细胞细胞信号传导和细胞循环袁 分子功能有肽酶调节活性和肽酶活性负调控遥 KEGG 通路分析结果显示袁 鸽蛋蛋清蛋白中富集程度较高的代谢通路有内质网的加工通路尧 溶酶体通路尧 HIF1 信号通路尧 吞噬体作用通路和铁死亡通路等遥 此外袁 鸽蛋中发现多种差异蛋白和特异蛋白在透明蛋清凝胶形成尧 小分子结合运输参与和组织伤口愈合等方面有潜在作用遥关键词院 鸽蛋曰 蛋清蛋白曰 蛋白组学曰 功能特性基金项目院 江苏省食品质量安全重点实验室开放课题 渊2022SBGJZZ16冤遥作者简介院 龚兰
3、渊1985冤袁 助理研究员袁 从事畜禽产品质量安全研究遥 Email院 gl_遥王冉 渊1973冤袁 研究员袁 从事畜禽产品质量安全研究遥 Email院 渊通讯作者冤遥 魏瑞成 渊1979冤袁研究员袁 从事畜禽产品质量安全研究遥 Email院 渊通讯作者冤遥蛋清蛋白是蛋中的主要成分袁 约占全蛋的60袁 包含卵白蛋白尧 卵类黏蛋白尧 卵转铁蛋白和溶菌酶等袁 为动物及人类的生长发育提供营养12遥此外袁 因其具有较高的生物利用价值和优良的加工特性袁 被广泛用于生物医药和食品加工行业遥 随着营养多元化和精细化的发展袁 鸽蛋因营养价值高袁成为高附加值产品袁 受到消费者的青睐遥 在我国的禽类生产中袁 鸽是
4、继鸡尧 鸭尧 鹅之后的第4大家禽袁 早在我国的叶本草纲目曳等传统医学典籍中就记载了鸽蛋具有解疮毒尧 痘毒和补肾益气等功效遥 除此之外袁 鸽蛋还有助于增强人体免疫及造血功能袁促进伤口愈合尧 产妇产后恢复等34遥 但是受到科研手段分析局限性的影响袁 对其功效成分及机理的研究尚未清楚遥 因此袁 越来越多的研究者开始对鸽蛋进行研究袁 挖掘鸽蛋更多的利用价值遥蛋白质组学技术的产生有助于深入研究食品的营养特性袁 服务人类健康遥 目前袁 蛋白组学技术已广泛应用于农产品营养品质的挖掘与分析尧 真假溯源尧 生产加工过程的物质变化等研究袁 其中差异蛋白组学方法为不同品种尧 不同加工处理方式下差异蛋白的研究提供了新
5、思路56遥 蛋清为胚胎发育提供了良好的环境和所需营养袁 国内外文献主要从物种差异尧 胚胎发育和生物安全等方面阐述禽蛋蛋白的作用遥WANG等7利用二维电泳和液相色谱串联质谱法鉴定出89个蛋白袁 包括蛋清中表达丰度较高的蛋白和酶类袁 但是对于多数低丰度蛋白仍然无法鉴定遥 随着质谱技术的发展袁 更多的功能性和丰度低的蛋白尧 肽类被发现袁 极大地丰富了蛋清蛋白组学数据库袁 为研究提供更多的数据支撑遥SUN等8通过TMTs定量技术对不同禽蛋蛋白蛋清进行蛋白组学研究袁 挖掘出多种差异蛋白袁 经主成分与聚类分析得到鸡尧 火鸡尧 鹌鹑的亲缘关系更近袁 鸭和鹅的亲缘性也很高袁 而鸽子与其他物种关系较远遥 蛋白组
6、学在鸡蛋蛋清蛋白和蛋黄蛋白方面有一定的研究和应用袁 构建了蛋白组学数据库袁 而其他禽产品蛋白组学研究报道较少913遥目前袁 关于鸽蛋蛋清蛋白的功能研究不够深入袁 本研究拟采用4D非标 渊Labelfree冤 蛋白质农产品质量与安全2023 年第 4 期组学技术构建禽蛋蛋白组学数据库袁 对鸽蛋和其他禽蛋进行差异蛋白组学分析袁 筛选差异蛋白袁 探究其功能及代谢通路袁 为揭示鸽蛋潜在的营养功能特性提供理论依据遥一尧 材料与方法渊一冤 仪器与试剂1.仪器与设备遥 酶标仪 渊瑞士帝肯公司冤曰Na-noelute液 相 串 联tims TOF Pro高 分 辨 质 谱 仪渊LCQTOF/MS袁 美国Bru
7、ker公司冤遥2.材料与试剂遥 二硫苏糖醇 渊DTT冤尧 碘乙酰胺 渊IAA冤尧 尿素 渊UA冤尧 碳酸氢铵尧 十二烷基硫酸钠 渊SDS冤尧 三羟甲基氨基甲烷 渊Tris冤渊美国Sig-ma公司冤曰 胰蛋白酶 渊美国Promega公司冤曰Ami-con Ultra0.5超滤管 渊10 kD袁 德国默克密理博公司冤曰C18固相萃取柱 渊德国Qiagen公司冤曰 乙腈尧甲酸 渊质谱级袁 美国Thermo Fisher公司冤曰BCA法蛋白定量试剂盒 渊上海碧云天生物技术有限公司冤曰 浓盐酸 渊分析纯袁 国药集团冤遥新鲜的鸡蛋尧 鸭蛋尧 鸽蛋尧 鹌鹑蛋和鹅蛋从当地的农贸市场购入袁 购入后放置于4冰箱中
8、遥渊二冤 实验方法1.前处理方法遥 挑选大小和质量相近的禽蛋渊鸡蛋尧 鸭蛋尧 鸽蛋尧 鹌鹑蛋和鹅蛋冤袁 每种禽蛋6个平行袁 共计30个样品遥 将禽蛋去除壳后分离蛋清尧 蛋黄袁 蛋清样品均质后分装在2.0 mL的离心管中袁 液氮猝灭样品后于80冰箱保存袁 待测遥取蛋清样品适量袁 加入尿素缓冲溶液 渊8mol/L尿素溶于100 mmol/L pH 7.6的TrisHCl缓冲液中冤 对样品中的蛋白质进行烷基化袁 然后采用BCA法进行蛋白质定量袁 根据测定结果袁 计算胰蛋白酶的使用量遥 将每个蛋白样品20滋g与5倍缓冲液混合袁 煮沸5 min遥 在12.5的SDSPAGE凝胶上分离蛋白袁 考马斯亮蓝R
9、250染色显示蛋白条带袁 检验蛋白提取的浓度及纯度遥 每个样品取适量蛋白质采用Filter aided proteome preparation渊FASP冤 方法进行胰蛋白酶酶解院 每个样品200滋g蛋白质加入30滋L SDT缓冲液 咱渊4SDS袁100mmol/L DTT袁150 mmol/L TrisHCl渊pH 8.0冤暂遥用UA缓冲液 咱8 mol/L尿素袁150 mmol/L TrisHCl渊pH 8.0冤暂 重复超滤 渊Microcon单位袁10 kD冤去除洗涤剂尧DTT和其他低相对分子质量组分袁然后加入100滋L碘乙酰胺 渊100 mmol/L IAA加入UA缓冲液中冤 阻断减少
10、的半胱氨酸残基袁 在黑暗中孵育30 min遥 用100滋L UA缓冲液洗涤3次袁之后用100滋L 25 mmol/L NH4HCO3缓冲液洗涤2次遥 最后袁 蛋白悬液用4滋g胰蛋白酶渊Promega冤 在40滋L 25 mmol/L NH4HCO3缓冲液中消化袁37过夜袁 收集得到的肽作为滤液遥 每个样品的肽段采用C18Cartridge进行脱盐袁 真空离心浓缩袁 肽段冻干后加入400滋L 0.1渊/冤 甲酸中重组复融遥 根据脊椎动物蛋白质中色氨酸和酪氨酸的频率计算袁以0.1渊g/L冤 溶液的消光系数为1.1袁 在280 nm处用紫外分光光度计计算肽的含量遥2.液相色谱串联质谱方法遥 样品采用
11、纳升流速的HPLC液相系统NanoElute进行分离袁 流动相A为0.1甲酸水袁B为0.1甲酸乙腈水袁 色谱柱以95的A液平衡袁 流速300 nL/min遥 样品经液相色谱分离后由times TOF Pro质谱仪分析遥 检测模式为正离子袁 离子源电压1.5 kV袁 质谱扫描范围1001 700/袁 数据采集模式为平行累积串行碎裂模式 渊PASEF冤遥3.蛋 白 鉴 定 与 定 量 遥 二 级 质 谱 数 据 采 用MaxQuant 1.5.3.17软件对每个样品的MS原始数据进行合并和检索袁 利用Uniprot数据库中不同禽类蛋白数据库进行比对分析袁 最终鉴定和定量分析遥4.生物信息学分析遥
12、表达差异分析使用检验和差异倍数值 渊Fold change袁FC冤 筛选两组禽蛋蛋清丰度差异蛋白袁 以FC2.0或0.5袁 且0.05渊 检验或其他冤 为标准袁 比较组间的上尧 下调蛋白数目遥 根据质谱鉴定结果袁 有与无的差异蛋白选取6次结果中4次及4次以上定量到的蛋白进行分析遥 使用Cluster 3.0和Java Treeview软件进行层次聚类分析遥GO分析利用NCBI BLAST2.2.28+客户端软件和InterProScan对筛选到的差异表达蛋白的蛋白序列进行局部搜索袁 寻找同源序列袁 利用Blast2 GO软件绘制基因本体 渊GO冤 术语并进行序列注释遥KEGG注释按照注释步骤袁
13、 将研究的蛋白质通过京都基因和基因组百科全书 渊KEGG冤 进行KEGG通路分析遥 富集分析将全部定量的蛋白质作为背景数据集袁 基于Fisher精确检验进行富集分析遥 多重测试的BenjaminiHochberg校正进一步用于调整导出的值遥 只有值在0.05阈值以下的功能类别和通路具有显著性遥二尧 结果与分析渊一冤 鸽蛋蛋清蛋白质数据库的构建本研究采用LCQTOF/MS结合4D非标定量蛋白质组学农产品质量与安全2023 年第 4 期技术构建鸽蛋等禽蛋蛋清蛋白数据库遥 在30个样本中共鉴定出699个蛋白质和多肽袁 包括500个鸽蛋蛋清蛋白尧399个鸡蛋蛋清蛋白尧227个鸭蛋蛋清蛋白尧292个鹅蛋
14、蛋清蛋白和389个鹌鹑蛋蛋清蛋白袁 分别占鉴定蛋白总数的71.5尧57.1尧32.5尧41.8和55.7袁 可以看出鸽蛋蛋清蛋白和肽段种类最丰富遥鸽蛋中高丰度蛋白分别有11种卵白蛋白尧15种卵类黏蛋白及其片段尧4种卵转铁蛋白和23种溶菌酶遥 作为蛋清蛋白的主要成分袁 卵白蛋白提供胚胎发育的营养物质曰 卵转铁蛋白是铁离子运输载体袁 具有抗氧化和抗菌功能曰 卵类黏蛋白抑制胰蛋白酶活性1415遥 此外袁 鸽蛋蛋清还包括结构蛋白渊如角蛋白尧 胶原蛋白和原肌球蛋白冤尧 细胞骨架蛋白 渊如肌动蛋白和微管蛋白冤尧 多种血液蛋白 渊如血红蛋白尧 球蛋白尧 膜联蛋白尧 纤维连接蛋白冤 和胚胎发育相关蛋白 渊如卵
15、黄蛋白尧 透明带精子结合蛋白尧 卵黄膜外层蛋白冤袁 还有一些特殊功能蛋白袁如成纤维细胞生长因子结合蛋白尧 载脂蛋白尧 胰岛素样生长因子结合蛋白7和受体蛋白等遥渊二冤 鸽蛋与其他禽蛋蛋清蛋白的差异性分析1.禽蛋蛋清蛋白主成分分析遥 对5种禽蛋蛋清蛋白进行主成分分析袁 获得的主成分分析图见图1遥 如图1所示袁 每个品种组内定量重现性较好袁PC1和PC2在5种禽蛋中占变异性的31.91和31.02袁 表明鸽蛋与鸡蛋尧 鹌鹑蛋尧 鹅蛋和鸭蛋的蛋清蛋白存在显著差异袁 其中鸽蛋与鹅蛋尧 鸭蛋蛋清蛋白种类相似度最低遥2.鸽蛋蛋清蛋白中差异蛋白的筛选和分析遥 将鸽蛋与鸡蛋尧 鸭蛋尧 鹅蛋尧 鹌鹑蛋两两比较袁
16、分别得到195尧320尧249尧187个蛋白显著上调袁93尧60尧76尧82个蛋白显著下调 渊见图2冤遥 聚类分析结果表明袁 鸽蛋蛋清蛋白与其他4种禽蛋蛋清蛋白相比袁44个蛋清蛋白显著上调袁3个蛋清蛋白显著下调 渊见图3冤遥 上调蛋白中主要包括ATP酶渊A0A2I0LND7冤尧 微精原蛋白 渊A0A669PPK8冤尧 核受体协同抑制因子 渊A0A2I0LUS7冤尧 转铁蛋白渊A0A2I0LIU5冤尧 溶菌酶 渊A0A2I0LIU5冤尧 内着丝粒蛋白 渊A0A2I0LIJ6冤尧 卵类黏蛋白转录变体X1渊A0A2I0LWI9冤尧 类核黄素连接蛋白渊A0A2I0LYY8冤尧半胱氨酸蛋白酶抑制剂 渊A
17、0A2I0LV75冤尧 载脂蛋白M渊A0A2I0LWC3冤尧 卵转铁蛋白 渊R7VVX1冤 和杀卵剂渊A0A2I0LWJ2冤遥 非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶渊A0A2I0MHD4冤尧VMO1渊A0A851NCC0冤 和DKK3渊A0A7K9VCG5冤 蛋白的表达量低于其他禽蛋蛋清蛋白遥在 野有无冶 差异比较中袁 鸽蛋蛋清中共筛选出314个特异蛋白袁 其中相较于鸡蛋尧 鸭蛋尧 鹅蛋尧鹌鹑蛋分别有69尧234尧148和71个蛋清蛋白只存在于鸽蛋中遥 将某一个禽蛋与其他4种禽蛋比较袁发现鸡蛋尧 鸭蛋尧 鹅蛋尧 鹌鹑蛋和鸽蛋中的特异蛋白个数分别是6尧1尧3尧6和18个袁 鸽蛋特异蛋白种类最多袁 主要
18、涉及裸蛋白尧 琢2巨球蛋白样蛋白1尧 载脂蛋白AI和H尧 琢2HS糖蛋白尧SPB10蛋白和钙网蛋白等 渊见表1冤遥3.鸽蛋蛋清蛋白的GO功能注释分析遥 对禽蛋蛋清蛋白的GO功能进行统计分析袁 鸽蛋蛋清中有88.0渊537/610冤 的蛋白映射到GO数据库中遥 对检测到的蛋白进行GO分类汇总和富集统计袁 将参与GO功能的蛋白数量按照由多到少排序袁 取蛋白数量前20位的GO功能进行作图比较 渊见图4冤遥所有蛋白质参与的生物过程类主要包括生化过程尧细胞过程尧 生物调节尧 生物过程调控尧 对刺激的反应和多种代谢过程 渊如有机物尧 氮化合物和大分子等代谢冤遥 在分子功能分类中袁 蛋清蛋白大部分物质可与小
19、分子代谢物尧 蛋白尧 铁离子和维生素等营养物质结合袁 发挥特殊的分子功能袁 除此之外还图 2鸽蛋与其他禽蛋蛋清蛋白质定量差异结果鸽蛋 vs 鸡蛋鸽蛋 vs 鹌鹑蛋鸽蛋 vs 鹅蛋鸽蛋 vs 鸭蛋10050050100150200250300350FC约0.5FC跃2某一禽蛋与鸽蛋相比所具有的特异蛋清蛋白275511624491011941862964126鸽蛋与某一禽蛋相比所具有的特异蛋清蛋白图 15 种禽蛋蛋清蛋白主成分分析图鸡蛋蛋清蛋白PC1渊31.91冤10123210123鸽蛋蛋清蛋白鹌鹑蛋蛋清蛋白鹅蛋蛋清蛋白鸭蛋蛋清蛋白农产品质量与安全2023 年第 4 期图 35 种禽蛋蛋清蛋白聚
20、类分析图注院 GDQ尧 EDQ尧 YDQ尧 JDQ 和 ADQ 分别指鸽蛋尧 鹅蛋尧 鸭蛋尧 鸡蛋和鹌鹑蛋的蛋清蛋白遥表 1与其他禽蛋相比鸽蛋蛋清中的特异蛋白登录号蛋白名称肽段覆盖率渊冤值G1MU34A0A7L0K302A0A2P4SY39A0A7L0WVG5A0A2I0M741A0A2I0LSL8A0A669P6F8A0A2I0LQE2A0A2I0LN28A0A669P0F0U3IT76A0A2I0MBF0A0A2I0MCY8F1ND88A0A7K9YD48A0A669PDI2A0A6J3DLJ8G1MVR3裸蛋白 1琢2巨球蛋白样蛋白 1渊片段冤未知蛋白SPB10 蛋白渊片段冤载脂蛋白 H
21、脱水酶结构域包含 14A丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域包含蛋白载脂蛋白 AI假定 LOC102091601狭缝导向配体 2钙网蛋白琢2HS糖蛋白卵黄膜外层蛋白 1胰岛素样生长因子结合蛋白 5高尔基体蛋白渊片段冤乙酰辅酶 A C十四烷基转移酶蛋白系同源 1角蛋白311121326319111123520.361.160.693.143.4518.467.9910.612.810.532.063.211.854.146.8813.016.064.49111111111111111111农产品质量与安全2023 年第 4 期参与多种催化活动尧 发挥水解酶活性和酶调节活性16遥 在细胞成分分类中袁 主要在细
22、胞成分中尧 细胞外区域或者细胞内袁 细胞膜上的表达相对较少遥不同禽蛋蛋清中绝大多数蛋白参与的生物过程基本相同袁 但是鸽蛋蛋清蛋白参与生物过程的数量多于鹅蛋和鸭蛋遥鸽蛋蛋清中的314个差异蛋白中50左右的差异蛋白存在于胞外区 渊148/314冤袁 参与酶活性调图 4鸽蛋尧 鸡蛋尧 鸭蛋尧 鹅蛋和鹌鹑蛋蛋清蛋白的 GO 二级注释分类统计A生物过程曰 B分子功能曰 C细胞功能050100150200250300AB050100150200250300350C050100150200250300350鸡蛋蛋清蛋白鸭蛋蛋清蛋白鹅蛋蛋清蛋白鹌鹑蛋蛋清蛋白鸽蛋蛋清蛋白鸡蛋蛋清蛋白鸭蛋蛋清蛋白鹅蛋蛋清蛋白鹌鹑
23、蛋蛋清蛋白鸽蛋蛋清蛋白鸡蛋蛋清蛋白鸭蛋蛋清蛋白鹅蛋蛋清蛋白鹌鹑蛋蛋清蛋白鸽蛋蛋清蛋白农产品质量与安全2023 年第 4 期节尧 生物调控尧 细胞代谢尧 蛋白水解等生物过程遥鸽蛋蛋清蛋白富集程度高且有显著性差异的生物过程有细胞细胞信号传导 渊GO院0007267冤 和细胞循环 渊GO院0007049冤曰 分子功能有肽酶调节活性渊GO院0061135冤和肽酶活性负调控渊GO院0030414冤曰细胞组分主要富集在内质网上遥 细胞细胞信号传导中有9个蛋白参与多细胞组织尧 神经系统尧 血管尧 细胞骨架等组织的生长发育和信号转导曰 细胞循环有9个蛋白参与细胞有丝分裂尧 细胞生长和细胞分离等过程遥 分别有5
24、9和58个蛋白富集在肽酶调节活性 渊GO院0061135冤 和肽酶活性负调控渊GO院0030414冤 功能上袁 包括卵黏蛋白尧 半胱氨酸蛋白酶抑制剂尧 胰蛋白酶抑制剂尧 卵转铁蛋白尧巨球蛋白和杀卵剂袁 所有这些蛋白在鸽蛋中含量较高袁 具有肽酶活性调节功能7遥 另外袁 鸽蛋中有13种蛋白富集在内质网上袁 发挥各自的功能遥 值得注意的是袁 鸽蛋蛋清中44种上调蛋白中有12种蛋白参与维生素尧 蛋白尧 脂质和金属元素的结合袁 包括钙粘着蛋白尧 类脂质运载蛋白尧 叶酸受体类蛋白和BPI折叠包含B族蛋白等曰 有7种蛋白 渊类卵黏蛋白尧 杀卵剂尧 半胱氨酸蛋白酶抑制剂尧 类补体因子D尧 组织蛋白酶B等冤 负
25、责酶类活性的正负调节遥4.鸽蛋蛋清蛋白的KEGG通路分析遥 在生物体内袁 机体的生物学功能通过蛋白质的相互作用构成信号通路来行使生物学功能遥 鸽蛋蛋清蛋白中富集程度较高的代谢通路有内质网的加工通路 渊通路编号为ko04141袁 通路中涉及的相关蛋白个数为14个冤尧 溶酶体通路 渊通路编号为ko04142袁 通路中涉及的相关蛋白个数为17个冤尧HIF1信号通路渊通路编号为ko04066袁 通路中涉及的相关蛋白个数为13个冤尧 吞噬体作用通路 渊通路编号为ko04145袁通路中涉及的相关蛋白个数为11个冤 和铁死亡通路 渊通路编号为ko04216袁 通路中涉及的相关蛋白个数为10个冤 等遥 在本研
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