基于LC-MS技术对镉胁迫下地钱代谢组的性别响应差异研究.pdf
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1、 年月四川大学学报(自然科学版)J u l 第 卷第期J o u r n a l o fS i c h u a nU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c eE d i t i o n)V o l N o 基于L C M S技术对镉胁迫下地钱代谢组的性别响应差异研究何静,易航,杨希,荣姝恬,王丽(四川大学生命科学学院,成都 )摘要:为探究雌雄异株植物响应重金属胁迫的性别差异,本研究利用超高效液相色谱结合四级杆飞行时间质谱仪(U P L C Q T O F M S)测定了镉(C d)胁迫下雌雄地钱(M a r c h a n t i ap o l
2、y m o r p h a)中的代谢产物,分析了与不同性别相关的差异代谢物和代谢通路结果显示,未受镉胁迫时,雌性地钱中类黄酮生物合成、嘌呤代谢和玉米素生物合成代谢水平高于雄性,芹菜素、木犀草素、腺嘌呤和腺苷含量显著高于雄性受镉胁迫后,雌性地钱中类黄酮生物合成、嘌呤代谢和玉米素生物合成代谢水平下降,芹菜素、木犀草素、矢车菊素 O 半乳糖苷、腺嘌呤和腺苷含量显著下降而雄性地钱中上述三条通路的代谢水平上升,刺槐苷、槲皮素、腺苷一磷酸和肌苷的含量显著上调研究表明,地钱响应镉胁迫的代谢变化出现了性别差异其中,雌性地钱降低了玉米素和遗传物质的合成水平,诱导谷胱甘肽的合成雄性地钱上调了玉米素合成,缓解叶绿素
3、的降解,同时上调类黄酮生物合成途径中的槲皮素和刺槐苷等具有抗氧化活性的次生代谢产物关键词:镉胁迫;地钱;性别响应差异;代谢组中图分类号:Q 文献标识码:AD O I:/j 收稿日期:基金项目:四川省科技计划项目(川林规函 号 )作者简介:何静(),女,四川遂宁人,硕士研究生,研究方向为植物学 E m a i l:j i n g h e s t u s c u e d u c n通讯作者:王丽 E m a i l:y z x j v i p c o mS t u d yo ng e n d e rr e s p o n s ed i f f e r e n c eo fM a r c h a n
4、 t i ap o l y m o r p h am e t a b o l o m eu n d e r c a d m i u ms t r e s sb a s e do nL C M S t e c h n i q u eHEJ i n g,Y IH a n g,Y ANGX i,R ONGS h u T i a n,WANGL i(C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e s,S i c h u a nU n i v e r s i t y,C h e n g d u ,C h i n a)A b s t r a c t:I no r d e r t
5、oe x p l o r e t h eg e n d e r d i f f e r e n c e s o f d i o e c i o u sp l a n t s i n r e s p o n s e t oh e a v ym e t a l s t r e s s,t h em e t a b o l i t e so fM a r c h a n t i ap o l y m o r p h au n d e rc a d m i u m(C d)s t r e s sw e r ed e t e r m i n e db yu l t r a p e r f o r m a
6、 n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o m b i n e dw i t hq u a d r u p o l e t i m e o f f l i g h tm a s s s p e c t r o m e t r y(U P L C Q T O F M S),a n d t h ed i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s a n dm e t a b o l i cp a t h w a y s r e l a t e d t od i f f e r e n t g e n d
7、e r sw e r e a n a l y z e d T h er e s u l t ss h o w e dt h a t,w i t h o u tc a d m i u ms t r e s s,t h el e v e l so f f l a v o n o i db i o s y n t h e s i s,p u r i n em e t a b o l i s ma n dz e a t i nb i o s y n t h e s i s i nf e m a l e sw e r eh i g h e r t h a nt h o s e i nm a l e sw
8、 i t hs i g n i f i c a n t l yh i g h e rc o n t e n t so f a p i g e n i n,l u t e o l i n,a d e n i n e a n da d e n o s i n e A f t e r c a d m i u ms t r e s s,t h e l e v e l so f f l a v o n o i db i o s y n t h e s i s,p u r i n em e t a b o l i s ma n dz e a t i nb i o s y n t h e s i s i n
9、f e m a l e sw e r ed e c r e a s e dw i t ht h es i g n i f i c a n td e c r e a s eo fa p i g e n i n,l u t e o l i n,c y a n i d i n O g a l a c t o s i d e,a d e n i n ea n da d e n o s i n e T h em e t a b o l i cl e v e l so ft h ea b o v et h r e ep a t h w a y si n c r e a s e di n m a l e s
10、w i t ht h es i g n i f i c a n ti n c r e a s eo fd i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s 第 卷四川大学学报(自然科学版)第期k a e m p f e r o l O r o b i n o s i d e O r h a m n o s i d e,q u e r c e t i n,a d e n o s i n em o n o p h o s p h a t ea n di n o s i n e S t u d i e sh a v es h o w ng e n d e rd i
11、 f f e r e n c e s i nm e t a b o l i cc h a n g e so fMp o l y m o r p h ai nr e s p o n s et oc a d m i u ms t r e s s Am o n gt h e m,f e m a l eMp o l y m o r p h ar e d u c e d t h e s y n t h e s i s l e v e l o f z e a t i na n dg e n e t i cm a t e r i a l,a n d i n d u c e dt h es y n t h e
12、 s i so fg l u t a t h i o n e M a l eMp o l y m o r p h ai n c r e a s e dz e a t i ns y n t h e s i s,a l l e v i a t e dc h l o r o p h y l l d e g r a d a t i o n,a n du p r e g u l a t e ds e c o n d a r ym e t a b o l i t e sw i t ha n t i o x i d a n ta c t i v i t ys u c ha sq u e r c e t i
13、na n dk a e m p f e r o l O r o b i n o s i d e O r h a m n o s i d e i nt h e f l a v o n o i db i o s y n t h e s i sp a t h w a y K e y w o r d s:C a d m i u ms t r e s s;M a r c h a n t i ap o l y m o r p h a;G e n d e r r e s p o n s ed i f f e r e n c e s;M e t a b o l o m e引言重金属是地壳的天然元素,由于工业发
14、展和人类活动造成重金属含量显著高于天然含量,导致环境中重金属污染的发生镉(C d)是一种有毒重金属,毒害植物,对生态系统构成风险,并在生态循环中危害人类健康重金属镉通过与其他矿物质元素竞争低特异性的F e/F e、Z n和M n转运蛋白进入植物,扰乱植物根系对矿质元素的吸收,导致植物体营养不足,生长受限甚至死亡镉胁迫诱导活性氧(R O S)的产生,影响植物细胞超微结构,降低叶绿素含量,抑制光合作用,与细胞核的相互作用导致D NA损伤、诱变损伤,影响植物的正常生理和生化过程此外,镉胁迫作用于植物代谢研究表明,镉胁迫抑制氨基酸和蛋白质的生物合成,影响嘌呤、碳和甘油脂代谢途径 雌雄异株植物是植物界的
15、重要组成成分,参与维持陆地生态系统结构和功能稳定在雌雄异株植物中,两性通常在形态和生理上表现出不同,这可能会造成群体性别比偏差 雌性偏倚的群体性别比是苔藓植物种群中一种常见的现象 如齿肋墙藓(S y n t r i c h i a c a n i n e r v i s)在海拔较高的区域雌、雄性别比为 雌雄间的性别差异在植物面对环境胁迫时尤为明显,导致雌雄个体对环境变化产生不同的生理代谢响应如酸雨胁迫下地钱(M a r c h a n t i ap o l y m o r p h a)雄配子体抗褪绿和抗氧化的能力要高于雌配子体,表现出对酸雨胁迫更强的耐受性,镉胁迫下雌性角齿藓(C e r a
16、t o d o np u r p u r e u s)对镉的耐受性高于雄性,干旱胁迫下雌性滇杨(P o p u l u sy u n n a n e n s i s)叶片中总酚、缩合单宁和类黄酮的含量下降且死亡率高于雄性 这些现象对种群结构和稳定性产生潜在影响,可能导致种群减少甚至灭绝地钱是典型的雌雄异株植物,隶属苔纲(H e p a t i c a e)地钱科(M a r c h a n t i n e a e)地钱属(M a r c h a n t i a)因其分布广,易培养,生长周期短,且基因组测序已完成,是研究植物响应环境胁迫的模型植物地钱富含生物活性化合物,如萜类、芳香化合物 研究表
17、明,地钱受到环境胁迫时,其代谢会发生显著变化以响应胁迫如创伤胁迫下地钱通过苯丙素途径合成木犀草素、芹菜素和i s o r i c c a r d i nC以抵御病原体的入侵 高温胁迫下地钱通过加强脱落酸(A B A)信号通路,以提高耐热性 低温条件下,地钱通过表达冷诱导的 去饱和酶基因,积累二十碳五烯酸以助于适应低温 前期研究表明,地钱受到镉胁迫时,在生理 和转录 上的变化表现出性别差异,然而其在代谢层面上的变化尚不明确因此,研究不同性别地钱在镉胁迫下的代谢反应差异有助于进一步理解雌雄异株植物响应重金属胁迫的分子机制代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后的“组学级联”的终点 通过对有机
18、体中代谢物的全面和无偏差的定性和定量分析,可了解有机体的遗传特性或对环境变化的响应液相色 谱 质 谱 联 用(L i q u i d C h r o m a t o g r a p h M a s sS p e c t r o m e t e r,L C M S)是植物代谢组学研究中的主要分析技术,可对许多极性和半极性代谢物进行检测和分析,是检测胁迫条件下雌雄植株代谢变化和差异分析的高效率途径本研究 以地 钱 为 材 料,通 过U P L C Q T O F M S测定镉胁迫下雌雄地钱中的代谢产物,确定与不同性别相关的差异代谢物和代谢通路,旨在从代谢水平阐明不同性别地钱对镉胁迫的响应差异,为深
19、入研究雌雄异株植物生态适应的性别差异和种群动态变化提供理论依据材料与方法 第期何静,等:基于L C M S技术对镉胁迫下地钱代谢组的性别响应差异研究第 卷 材料地钱(M a r c h a n t i ap o l y m o r p h a)均采于四川省成都市武侯区望江公园(E,N)方法 地钱的培养和镉胁迫处理根据生殖托分别挑选雄配子体和雌配子体进行培养,培养条件参照Y o s h i k a w a等,镉胁迫处理方式参照杨茹画等,胁迫处理时间为 d,以蒸馏水处理的为对照,每个实验处理设个生物学重复 样品制备选取对照组和处理组中处于有性生殖阶段、含生殖托的地钱配子体为材料,分别为雌性对照组(
20、F)、雄性对照组(M)、雌性处理组(F)、雄性处理组(M)各准确称取 g,加液氮研磨成粉,将粉末转移至预冷的 m L离心管中,加入m L 甲醇(m L色谱纯甲醇加入 m L纯水),震荡混匀,冰箱过夜取 m L溶液于 m L离心管中,下 r/m i n离心m i n,取m L上清液,过 m微孔滤膜,将样品转移至进样瓶中,准备进样每个处理做个生物学重复 U P L C QT O F M S实验检测条件色谱条件:色 谱 柱 为A g i l e n tZ O R B A X S B C R a p i dR e s o l u t i o nHD mm mm M i c r o n;柱温;进样量L,
21、流速 m L/m i n,流动相A:F Ad d HO(甲酸水溶液),流动 相B:A C N F A(甲酸乙腈溶液)终止时间:m i n,色谱梯度洗脱程序如表表色谱梯度洗脱程序T a b C h r o m a t o g r a p h i cg r a d i e n t e l u t i o np r o g r a mT i m e/m i nF l o w/(m L/m i n)B C o n c/在I D A模式下采集数据离子源:E S I,扫描类型:T O FM S M S离子喷涂电压分别为 V(负离子模式)、V(正离子模式),C A D气体,质量扫描范围(m/z)数据处理利用
22、M S D I A L(V ),对数据进 行 峰 提 取、峰 对 齐 以 及 降 噪 处 理,普 库:M a s s B a n ko fN o r t hAm e r i c a(M o NA),保留时间容忍度 ,匹配度,最小峰宽,最小峰高 加合离子:MH、MNH、MN a、MCHOHH、MK、ML i、MH、MNH、MN a、MK,M H、M HO H、MN a H、MC l、MK H、M H得到化合物的精确分子量、保留时间、荷质比、加合离子、二级质谱碎片信息、离子响应强度和峰面积等数据信息采用M e t a b o A n a l y s t 进行统计分析,根据拉依达准则(P a u t
23、 ac r i t e r i o n)对数据进行标准差(S t a n d a r dD e v i a t i o n,S D)过滤处理通过T检验和F o l dc h a n g e(F C)筛选性别间和性别内差异代谢物,筛选标准为P (经F D R矫正)、|l o g(f o l dc h a n g e)|以l o g(F C)的值表示差异代谢物上调(l o g(F C)或下调(l o g(F C)的程度利用K E G G数据库进行通路分析,G r a p h P a dP r i s m 作代谢物含量图,j v e n作韦恩图,R(V )作K E G G通路富集图结果与分析 镉胁迫
24、下雌雄地钱表型特征用 m g/L氯化镉溶液处理 d后,雌雄地钱均出现了失绿现象,雌性失绿程度较雄性更严重(图)图镉处理后地钱形态F:雌性地钱;M:雄性地钱;B a r sc mF i g M o r p h o l o g i e so fMp o l y m o r p h aa f t e rc a d m i u mt r e a t m e n tF:f e m a l e s;M:m a l e s;b a r sc m 镉胁迫下雌雄地钱的代谢组分析基于物质的分子量、保留时间、质谱碎片信息和 匹配度,本研究共检测出 种代谢产物,包括 种初生代谢产物和 种次生代谢物(表 第 卷四川大学
25、学报(自然科学版)第期)物质种类最丰富的是脂质(种),其次是类黄酮(种)、苯类(种)、萜类(种)、氨基酸(种)、有机酸(种)、苯丙素类(种)、胺(种)、生物碱(种)、糖类(种)等对M、F、M、F 进行偏最小二乘判别分析(P a r t i a l L e a s t S q u a r e s D i s c r i m i n a n t A n a l y s i s,P L S D A)(图 a)c o m p o n e n t 分离了对照组和处理组,解释了 的总变异,表明镉处理诱导了地钱的生物学响应;c o m p o n e n t分离了对照组和处理组中的雌性和雄性地钱,解释了的总
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