基于LC-MS技术对镉胁迫下地钱代谢组的性别响应差异研究.pdf

年月四川大学学报(自然科学版)J u l 第 卷第期J o u r n a l o fS i c h u a nU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c eE d i t i o n)V o l N o 基于L C M S技术对镉胁迫下地钱代谢组的性别响应差异研究何静,易航,杨希,荣姝恬,王丽(四川大学生命科学学院,成都 )摘要:为探究雌雄异株植物响应重金属胁迫的性别差异,本研究利用超高效液相色谱结合四级杆飞行时间质谱仪(U P L C Q T O F M S)测定了镉(C d)胁迫下雌雄地钱(M a r c h a n t i ap o l y m o r p h a)中的代谢产物,分析了与不同性别相关的差异代谢物和代谢通路结果显示,未受镉胁迫时,雌性地钱中类黄酮生物合成、嘌呤代谢和玉米素生物合成代谢水平高于雄性,芹菜素、木犀草素、腺嘌呤和腺苷含量显著高于雄性受镉胁迫后,雌性地钱中类黄酮生物合成、嘌呤代谢和玉米素生物合成代谢水平下降,芹菜素、木犀草素、矢车菊素 O 半乳糖苷、腺嘌呤和腺苷含量显著下降而雄性地钱中上述三条通路的代谢水平上升,刺槐苷、槲皮素、腺苷一磷酸和肌苷的含量显著上调研究表明,地钱响应镉胁迫的代谢变化出现了性别差异其中,雌性地钱降低了玉米素和遗传物质的合成水平,诱导谷胱甘肽的合成雄性地钱上调了玉米素合成,缓解叶绿素的降解,同时上调类黄酮生物合成途径中的槲皮素和刺槐苷等具有抗氧化活性的次生代谢产物关键词:镉胁迫;地钱;性别响应差异;代谢组中图分类号:Q 文献标识码:AD O I:/j 收稿日期:基金项目:四川省科技计划项目(川林规函 号 )作者简介:何静(),女,四川遂宁人,硕士研究生,研究方向为植物学 E m a i l:j i n g h e s t u s c u e d u c n通讯作者:王丽 E m a i l:y z x j v i p c o mS t u d yo ng e n d e rr e s p o n s ed i f f e r e n c eo fM a r c h a n t i ap o l y m o r p h am e t a b o l o m eu n d e r c a d m i u ms t r e s sb a s e do nL C M S t e c h n i q u eHEJ i n g,Y IH a n g,Y ANGX i,R ONGS h u T i a n,WANGL i(C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e s,S i c h u a nU n i v e r s i t y,C h e n g d u ,C h i n a)A b s t r a c t:I no r d e r t oe x p l o r e t h eg e n d e r d i f f e r e n c e s o f d i o e c i o u sp l a n t s i n r e s p o n s e t oh e a v ym e t a l s t r e s s,t h em e t a b o l i t e so fM a r c h a n t i ap o l y m o r p h au n d e rc a d m i u m(C d)s t r e s sw e r ed e t e r m i n e db yu l t r a p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o m b i n e dw i t hq u a d r u p o l e t i m e o f f l i g h tm a s s s p e c t r o m e t r y(U P L C Q T O F M S),a n d t h ed i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s a n dm e t a b o l i cp a t h w a y s r e l a t e d t od i f f e r e n t g e n d e r sw e r e a n a l y z e d T h er e s u l t ss h o w e dt h a t,w i t h o u tc a d m i u ms t r e s s,t h el e v e l so f f l a v o n o i db i o s y n t h e s i s,p u r i n em e t a b o l i s ma n dz e a t i nb i o s y n t h e s i s i nf e m a l e sw e r eh i g h e r t h a nt h o s e i nm a l e sw i t hs i g n i f i c a n t l yh i g h e rc o n t e n t so f a p i g e n i n,l u t e o l i n,a d e n i n e a n da d e n o s i n e A f t e r c a d m i u ms t r e s s,t h e l e v e l so f f l a v o n o i db i o s y n t h e s i s,p u r i n em e t a b o l i s ma n dz e a t i nb i o s y n t h e s i s i nf e m a l e sw e r ed e c r e a s e dw i t ht h es i g n i f i c a n td e c r e a s eo fa p i g e n i n,l u t e o l i n,c y a n i d i n O g a l a c t o s i d e,a d e n i n ea n da d e n o s i n e T h em e t a b o l i cl e v e l so ft h ea b o v et h r e ep a t h w a y si n c r e a s e di n m a l e sw i t ht h es i g n i f i c a n ti n c r e a s eo fd i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s 第 卷四川大学学报(自然科学版)第期k a e m p f e r o l O r o b i n o s i d e O r h a m n o s i d e,q u e r c e t i n,a d e n o s i n em o n o p h o s p h a t ea n di n o s i n e S t u d i e sh a v es h o w ng e n d e rd i f f e r e n c e s i nm e t a b o l i cc h a n g e so fMp o l y m o r p h ai nr e s p o n s et oc a d m i u ms t r e s s Am o n gt h e m,f e m a l eMp o l y m o r p h ar e d u c e d t h e s y n t h e s i s l e v e l o f z e a t i na n dg e n e t i cm a t e r i a l,a n d i n d u c e dt h es y n t h e s i so fg l u t a t h i o n e M a l eMp o l y m o r p h ai n c r e a s e dz e a t i ns y n t h e s i s,a l l e v i a t e dc h l o r o p h y l l d e g r a d a t i o n,a n du p r e g u l a t e ds e c o n d a r ym e t a b o l i t e sw i t ha n t i o x i d a n ta c t i v i t ys u c ha sq u e r c e t i na n dk a e m p f e r o l O r o b i n o s i d e O r h a m n o s i d e i nt h e f l a v o n o i db i o s y n t h e s i sp a t h w a y K e y w o r d s:C a d m i u ms t r e s s;M a r c h a n t i ap o l y m o r p h a;G e n d e r r e s p o n s ed i f f e r e n c e s;M e t a b o l o m e引言重金属是地壳的天然元素,由于工业发展和人类活动造成重金属含量显著高于天然含量,导致环境中重金属污染的发生镉(C d)是一种有毒重金属,毒害植物,对生态系统构成风险,并在生态循环中危害人类健康重金属镉通过与其他矿物质元素竞争低特异性的F e/F e、Z n和M n转运蛋白进入植物,扰乱植物根系对矿质元素的吸收,导致植物体营养不足,生长受限甚至死亡镉胁迫诱导活性氧(R O S)的产生,影响植物细胞超微结构,降低叶绿素含量,抑制光合作用,与细胞核的相互作用导致D NA损伤、诱变损伤,影响植物的正常生理和生化过程此外,镉胁迫作用于植物代谢研究表明,镉胁迫抑制氨基酸和蛋白质的生物合成,影响嘌呤、碳和甘油脂代谢途径 雌雄异株植物是植物界的重要组成成分,参与维持陆地生态系统结构和功能稳定在雌雄异株植物中,两性通常在形态和生理上表现出不同,这可能会造成群体性别比偏差 雌性偏倚的群体性别比是苔藓植物种群中一种常见的现象 如齿肋墙藓(S y n t r i c h i a c a n i n e r v i s)在海拔较高的区域雌、雄性别比为 雌雄间的性别差异在植物面对环境胁迫时尤为明显,导致雌雄个体对环境变化产生不同的生理代谢响应如酸雨胁迫下地钱(M a r c h a n t i ap o l y m o r p h a)雄配子体抗褪绿和抗氧化的能力要高于雌配子体,表现出对酸雨胁迫更强的耐受性,镉胁迫下雌性角齿藓(C e r a t o d o np u r p u r e u s)对镉的耐受性高于雄性,干旱胁迫下雌性滇杨(P o p u l u sy u n n a n e n s i s)叶片中总酚、缩合单宁和类黄酮的含量下降且死亡率高于雄性 这些现象对种群结构和稳定性产生潜在影响,可能导致种群减少甚至灭绝地钱是典型的雌雄异株植物,隶属苔纲(H e p a t i c a e)地钱科(M a r c h a n t i n e a e)地钱属(M a r c h a n t i a)因其分布广,易培养,生长周期短,且基因组测序已完成,是研究植物响应环境胁迫的模型植物地钱富含生物活性化合物,如萜类、芳香化合物 研究表明,地钱受到环境胁迫时,其代谢会发生显著变化以响应胁迫如创伤胁迫下地钱通过苯丙素途径合成木犀草素、芹菜素和i s o r i c c a r d i nC以抵御病原体的入侵 高温胁迫下地钱通过加强脱落酸(A B A)信号通路,以提高耐热性 低温条件下,地钱通过表达冷诱导的 去饱和酶基因,积累二十碳五烯酸以助于适应低温 前期研究表明,地钱受到镉胁迫时,在生理 和转录 上的变化表现出性别差异,然而其在代谢层面上的变化尚不明确因此,研究不同性别地钱在镉胁迫下的代谢反应差异有助于进一步理解雌雄异株植物响应重金属胁迫的分子机制代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后的“组学级联”的终点 通过对有机体中代谢物的全面和无偏差的定性和定量分析,可了解有机体的遗传特性或对环境变化的响应液相色 谱 质 谱 联 用(L i q u i d C h r o m a t o g r a p h M a s sS p e c t r o m e t e r,L C M S)是植物代谢组学研究中的主要分析技术,可对许多极性和半极性代谢物进行检测和分析,是检测胁迫条件下雌雄植株代谢变化和差异分析的高效率途径本研究 以地 钱 为 材 料,通 过U P L C Q T O F M S测定镉胁迫下雌雄地钱中的代谢产物,确定与不同性别相关的差异代谢物和代谢通路,旨在从代谢水平阐明不同性别地钱对镉胁迫的响应差异,为深入研究雌雄异株植物生态适应的性别差异和种群动态变化提供理论依据材料与方法 第期何静,等:基于L C M S技术对镉胁迫下地钱代谢组的性别响应差异研究第 卷 材料地钱(M a r c h a n t i ap o l y m o r p h a)均采于四川省成都市武侯区望江公园(E,N)方法 地钱的培养和镉胁迫处理根据生殖托分别挑选雄配子体和雌配子体进行培养,培养条件参照Y o s h i k a w a等,镉胁迫处理方式参照杨茹画等,胁迫处理时间为 d,以蒸馏水处理的为对照,每个实验处理设个生物学重复 样品制备选取对照组和处理组中处于有性生殖阶段、含生殖托的地钱配子体为材料,分别为雌性对照组(F)、雄性对照组(M)、雌性处理组(F)、雄性处理组(M)各准确称取 g,加液氮研磨成粉,将粉末转移至预冷的 m L离心管中,加入m L 甲醇(m L色谱纯甲醇加入 m L纯水),震荡混匀,冰箱过夜取 m L溶液于 m L离心管中,下 r/m i n离心m i n,取m L上清液,过 m微孔滤膜,将样品转移至进样瓶中,准备进样每个处理做个生物学重复 U P L C QT O F M S实验检测条件色谱条件:色 谱 柱 为A g i l e n tZ O R B A X S B C R a p i dR e s o l u t i o nHD mm mm M i c r o n;柱温;进样量L,流速 m L/m i n,流动相A:F Ad d HO(甲酸水溶液),流动 相B:A C N F A(甲酸乙腈溶液)终止时间:m i n,色谱梯度洗脱程序如表表色谱梯度洗脱程序T a b C h r o m a t o g r a p h i cg r a d i e n t e l u t i o np r o g r a mT i m e/m i nF l o w/(m L/m i n)B C o n c/在I D A模式下采集数据离子源:E S I,扫描类型:T O FM S M S离子喷涂电压分别为 V(负离子模式)、V(正离子模式),C A D气体,质量扫描范围(m/z)数据处理利用M S D I A L(V ),对数据进 行 峰 提 取、峰 对 齐 以 及 降 噪 处 理,普 库:M a s s B a n ko fN o r t hAm e r i c a(M o NA),保留时间容忍度 ,匹配度,最小峰宽,最小峰高 加合离子:MH、MNH、MN a、MCHOHH、MK、ML i、MH、MNH、MN a、MK,M H、M HO H、MN a H、MC l、MK H、M H得到化合物的精确分子量、保留时间、荷质比、加合离子、二级质谱碎片信息、离子响应强度和峰面积等数据信息采用M e t a b o A n a l y s t 进行统计分析,根据拉依达准则(P a u t ac r i t e r i o n)对数据进行标准差(S t a n d a r dD e v i a t i o n,S D)过滤处理通过T检验和F o l dc h a n g e(F C)筛选性别间和性别内差异代谢物,筛选标准为P (经F D R矫正)、|l o g(f o l dc h a n g e)|以l o g(F C)的值表示差异代谢物上调(l o g(F C)或下调(l o g(F C)的程度利用K E G G数据库进行通路分析,G r a p h P a dP r i s m 作代谢物含量图,j v e n作韦恩图,R(V )作K E G G通路富集图结果与分析 镉胁迫下雌雄地钱表型特征用 m g/L氯化镉溶液处理 d后,雌雄地钱均出现了失绿现象,雌性失绿程度较雄性更严重(图)图镉处理后地钱形态F:雌性地钱;M:雄性地钱;B a r sc mF i g M o r p h o l o g i e so fMp o l y m o r p h aa f t e rc a d m i u mt r e a t m e n tF:f e m a l e s;M:m a l e s;b a r sc m 镉胁迫下雌雄地钱的代谢组分析基于物质的分子量、保留时间、质谱碎片信息和 匹配度,本研究共检测出 种代谢产物,包括 种初生代谢产物和 种次生代谢物(表 第 卷四川大学学报(自然科学版)第期)物质种类最丰富的是脂质(种),其次是类黄酮(种)、苯类(种)、萜类(种)、氨基酸(种)、有机酸(种)、苯丙素类(种)、胺(种)、生物碱(种)、糖类(种)等对M、F、M、F 进行偏最小二乘判别分析(P a r t i a l L e a s t S q u a r e s D i s c r i m i n a n t A n a l y s i s,P L S D A)(图 a)c o m p o n e n t 分离了对照组和处理组,解释了 的总变异,表明镉处理诱导了地钱的生物学响应;c o m p o n e n t分离了对照组和处理组中的雌性和雄性地钱,解释了的总变异,表明雌雄间存在显著的生物学差异苔色酸(O r s e l l i n i ca c i d)、脱镁叶绿酸盐A(P h e o p h o r b i d eA)、芥 酸 酰 胺(E r u c a m i d e)、月 桂 基 二 乙 醇 胺(L a u r y l d i e t h a n o l a m i n e)、,二羟基苯乙酸(,D i h y d r o x y p h e n y l a c e t i ca c i d)在c o m p o n e n t上载荷较 大;苔 色 酸、芹 菜 素(A p i g e n i n)、木 犀 草 素(L u t e o l i n)在c o m p o n e n t 上载荷较大(图 b)通过交叉验证(C r o s s V a l i d a t i o n,C V)计算得出累计Q ,R ,说明本模型具有良好的稳定性和预测能力对本模型进行 次置换检验,P ,说明构建的模型并未产生过拟合现象以上结果表示,本模型可用于不同处理和性别的识别与区分表鉴定的代谢产物统计T a b S t a t i s t i c so f i d e n t i f i e dm e t a b o l i t e s物质种类数量初生代谢产物(种)脂质 氨基酸类 有机酸 糖嘧啶维生素核苷核苷酸次生代谢产物(种)类黄酮 苯类 萜类 苯丙素类 生物碱 胺 酚酯酮醇吡喃蒽醛喹啉呋喃其他吲哚类双苄吡咯醚图各组雌雄地钱代谢物的P L S D A分析(a)P L S D A得分图;(b)P L S D A载荷图F i g P L S D Aa n a l y s i so fm e t a b o l i t e s i ne a c hg r o u po fm a l ea n df e m a l eMp o l y m o r p h a(a)P C As c o r ep l o t s;(b)P C Al o a d i n gp l o t s 镉胁迫下雌雄地钱性别间差异代谢物及代谢通路分析为探明镉胁迫下,地钱响应胁迫的代谢变化,以P 和|l o g(F C)|为标准,分别对地钱在镉处理后性别内/间的代谢物变化进行了筛选和分析结果显示,与对照组相比,处理组雌性地钱中 第期何静,等:基于L C M S技术对镉胁迫下地钱代谢组的性别响应差异研究第 卷的代谢产物有 种上调,种下调;处理组雄性地钱中的代谢产物有 种上调,种下调(图)在上调或下调的差异代谢物中,雌性特有上调、下调代谢物分别是种和 种;雄性特有上调、下调代谢物分别是 种和 种;雌雄共同上调、下调代谢物分别是 种和 种(图)图镉胁迫下雌雄地钱差异代谢物统计F i g S t a t i s t i c so fd i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e si nm a l ea n df e m a l eMp o l y m o r p h au n d e r c a d m i u ms t r e s s地钱响应镉胁迫的差异代谢物主要有类,其中,脂质类代谢物最多(雌性上/下调/种;雄性上/下调/种),其次是黄酮类(雌性上/下调/种;雄性上/下调/种),苯类、氨基酸类、苯丙素类、萜类、有机酸类和糖类代谢物数量依次减少,胺类代谢物数量最少(图)分别对上述各性别内差异代谢物进行K E G G通路富集分析,结果表明雌性、雄性差异代谢物分别富集到 条、条代谢通路其中,亚油酸代谢,次生代谢物的生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,异喹啉生物碱生物合成,C 支链二元酸代谢,酪氨酸代谢,柠檬酸循环,角质、软木脂和蜡的生物合成,色氨酸代谢,核黄素代谢,亚麻酸代谢等 条代谢通路 在雌雄地钱 中均显著 富集(P a t h w a y i m p a c t)对性 别 特 有 上/下 调 的 差 异 代 谢 物 进 行K E G G通路富集分析,结果表明,雌性特异性上调、下调差异代谢物分别富集到条(图 a)、条(图 b)代谢通路;雄性特异性上调、下调差异代谢物分别富集到 条(图 c)、条(图 d)代谢通路其中,类黄酮生物合成途径在雌、雄地钱的性别特异性变化代谢物中均有富集,玉米素生物合成和嘌呤代谢在雄性中上调而在雌性中下调因此,选择类黄酮生物合成、玉米素生物合成和嘌呤代谢途径进行分析图镉胁迫下地钱性别内差异代谢物的主要类别和数目F i g M a i nc a t e g o r i e sa n dn u m b e ro fd i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s i nm a l e(M)a n df e m a l e(F)Mp o l y m o r p h au n d e rc a d m i u ms t r e s s对参与类黄酮生物合成代谢途径的差异代谢物及其衍生物进行分析结果表明,与对照组相比,柚皮素查尔酮(N a r i n g e n i nc h a l c o n e)在雌性地钱中显著上调(P ,l o g(F C),在雄性中被过滤,未参与差异分析芹菜素、木犀草素、矢车 菊 素 O 半 乳 糖 苷(C y a n i d i n O g a l a c t o s i d e)在雌性地钱中显著下调(P ,l o g(F C)分别为 、);在雄性中差异不显著(P )刺槐苷(K a e m p f e r o l O r o b i n o s i d e O r h a m n o s i d e)在雄性地钱中显著上调(P ,l o g(F C),在雌性中无显著差异(P )槲皮素(Q u e r c e t i n)在雄性地钱中显著上调(P ,l o g(F C),在雌性中被过滤,未参与差异分析对参与玉米素生物合成和嘌呤代谢代谢途径的差异代谢物进行分析,雌性地钱中腺嘌呤(A d e n i n e)、腺苷(A d e n o s i n e)显著下 调(P ,l o g(F C)分 别 为 、),而在雄性中没有显著差异(P )雄性地钱中腺苷一磷酸(AMP)、肌苷(I n o s i n e)显著 上 调(P ,l o g(F C)分 别 为 、),在雌性没有显著差异(P )(图)第 卷四川大学学报(自然科学版)第期图镉胁迫下地钱性别特异性差异代谢物K E G G代谢通路富集分析统计(a)雌性特异性上调差异代谢物通路富集结果;(b)雌性特异性下调差异代谢物通路富集结果;(c)雄性特异性上调差异代谢物通路富集结果;(d)雄性特异性下调差异代谢物通路富集结果F i g S t a t i s t i c so fK E G Ge n r i c h m e n t a n a l y s i so f s e x s p e c i f i cd i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s i nMp o l y m o r p h au n d e r c a d m i u ms t r e s s(a)P a t h w a y se n r i c h m e n t r e s u l t so f f e m a l e s p e c i f i cu p r e g u l a t e dd i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s;(b)P a t h w a y se n r i c h m e n tr e s u l t so f f e m a l e s p e c i f i cd o w n r e g u l a t e dd i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s;(c)P a t h w a y se n r i c h m e n t r e s u l t so fm a l e s p e c i f i cu p r e g u l a t e dd i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s;(d)P a t h w a y se n r i c h m e n t r e s u l t so fm a l e s p e c i f i cd o w n r e g u l a t e dd i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s图性别特异性上调或下调的差异代谢物及其衍生物在各组中的含量其中,由于雌性中的槲皮素和雄性中的柚皮素查尔酮被过滤,相应数据未显示“”表示差异显著(P )F i g C o n t e n t so fd i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e sa n d i t sd e r i v a t i v e s i ne a c hg r o u pw i t hs e x s p e c i f i cu po rd o w nr e g u l a t i o nAm o n gt h e m,s i n c eq u e r c e t i n i nf e m a l e sa n dn a r i n g e n i nc h a l c o n e i nm a l e sw e r ef i l t e r e d,t h ec o r r e s p o n d i n gd a t aw e r en o ts h o w n m e a n ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e(P )第期何静,等:基于L C M S技术对镉胁迫下地钱代谢组的性别响应差异研究第 卷为探明镉胁迫下地钱性别间的代谢水平差异,以P 和|l o g(F C)|为标准,分别比较处理组和对照组中雌雄地钱各代谢物含量,结果显示,对照组雌性地钱中有 种代谢物的含量显著高于雄性,种代谢物的含量低于雄性处理组雌性地钱中柚皮素查尔酮含量显著高于雄性(P ,l o g(F C)对这 种差异代谢物进行代谢通路分析,共富集到代谢通路,包括类黄酮生物合成、玉米素生物合成和嘌呤代谢等类黄酮生物合成途径中,对照组雌性地钱中芹菜素和木犀草素的含量显著高于雄性(P ,l o g(F C)分别为 和 );玉米素生物合成和嘌呤代谢途径中,对照组雌性地钱中腺嘌呤和腺苷的含量显著高于雄性(P ,l o g(F C)分别为 和 )讨论本研究利用L C M S技术,对镉胁迫下地钱的代谢物进行了定性和定量分析,共检测到 种代谢产物,其中包括脂质、氨基酸等 种初生代谢产物和类黄酮等 种次生代谢产物 P L S D A分析显示 个样本聚成四个不同的簇,指示镉胁迫诱导了地钱的生物学响应,代谢产物出现了明显的组间和性别间差异其中,部分脂质、氨基酸、有机酸等代谢物的含量显著变化,而且参与类黄酮生物合成、玉米素生物合成和嘌呤代谢的物质在两性中的变化趋势不同重金属对植物产生毒害作用,使植物体内的代谢过程发生紊乱,直接影响植物生长发育 与此同时,植物通过调整某些代谢物含量以响应胁迫如镉胁迫下水稻(O r y z a s a t i v a)脂质、有机酸和氨基酸 分泌量明显增加本研究中,处理组与相应的对照组相比,共有 种相同代谢物发生显著变化显著上调的主要为脂质和氨基酸,显著下调的主要为类黄酮和糖类,有机酸类部分上调部分下调涉及到脂质、氨基酸代谢以及次生代谢产物的生物合成等代谢途径脂质是细胞膜的组成成分,氨基酸和有机酸参与植物中重金属的积累与解毒,这三类物质在地钱中上调,推测是用于维护细胞膜正常的结构和功能,螯合重金属,维持渗透平衡此外,与镉胁迫下曼陀罗(D a t u r aS t r a m o n i u m)中可溶性碳水化合物下调的结果类似,镉处理后地钱的碳固定通路代谢水平下降,糖类下调这将会影响地钱的正常生长发育图镉胁迫下地钱类黄酮生物合成通路中代谢物含量变化灰色字体为未检测到的代谢物,实线箭头表示直接反应,虚线箭头表示间接反应,热图表示差异代谢物的的含量,虚线的空白方块表示该物质在对应组分中被过滤,未参与差异分析F i g C h a n g e s i n t h e c o n t e n t o fm e t a b o l i t e s r e l a t e d t o f l a v o n o i db i o s y n t h e s i sp a t h w a y i nMp o l y m o r p h au n d e r c a d m i u ms t r e s sT h eg r a yf o n t r e p r e s e n t sm e t a b o l i t e su n d e t e c t e d,t h e s o l i d l i n ea r r o wi n d i c a t e s ad i r e c t r e a c t i o n,t h ed o t t e d l i n e a r r o wi n d i c a t e s a n i n d i r e c t r e a c t i o n,a n dh e a tm a p ss h o wt h ec o n t e n to f t h ed i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s,d o t t e db l a n ks q u a r e s i n d i c a t et h a t t h es u b s t a n c e i s f i l t e r e d i nt h ec o r r e s p o n d i n gg r o u pa n d i sn o tu s e dw i t ha n yv a r i a n c ea n a l y s i s与前期对地钱响应镉胁迫的转录组性别差异研究结果相同,雄性地钱中性别差异代谢物也显著富集在类黄酮生物代谢途径上黄酮类物质已被证实在植物抵抗环境胁迫过程中起着核心作用 研究表明,干旱胁迫下黄丝瓜藓(P o h l i an u t a n s)中类黄酮上调,与抗氧化酶和解毒蛋白的上调起协同作用 UV B胁迫的地钱(Mp o l y m o r p h a)中木犀草素 上调以提高 抗氧化防御 水 第 卷四川大学学报(自然科学版)第期平 镉胁迫下洋甘菊(M a t r i c a r i ac h a m o m i l l a)中的芹 菜 素 和 钼(M o)胁 迫 下 大 豆(G l y c i n em a x)中的槲皮素 上调以满足抗氧化需求和螯合重金属然而在胁迫条件下,类黄酮含量并不总是增加类黄酮的合成依赖于初生代谢提供的碳源研究表明,镉胁迫下,刺槐(Rp s e u d o a c a c i a)叶片中可溶性糖与总黄酮含量显著正相关 干旱胁迫下,菊科植物A c h i l l e ap a c h y c e p h a l a中总黄酮含量在胁迫后期下降,归因可用碳的减少 本研究中,对照组雌性地钱芹菜素、木犀草素以及总黄 酮 含 量(g/g FW)显 著 大 于 雄 性(g/g FW)(P ),指示雌性类黄酮生物合成水平更高镉胁迫 天后,雌、雄地钱中总黄酮含量均显著下降这可能是由于可用碳的减少在类黄酮合成通路中,柚皮素查尔酮通过合成柚皮素进一步生成黄酮,也可以通过合成二氢黄酮醇进一步生成黄酮醇研究表明,来自于黄丝瓜藓(P o h l i an u t a n s)的I型黄酮合酶(P n F N S I)催化柚皮素合成芹菜素,该酶的过表达增强了植物中黄酮的累积 本研究中,受镉胁迫后,雌性中柚皮素查尔酮上调,芹菜素和木犀草素下调(图)这可能是由于镉降低了雌性中催化芹菜素和木犀草素合成的酶活性与雌性不同,雄性中槲皮素和刺槐苷含量显著上调(图)有研究表明类黄酮抗氧化能力和羟基数量有关,具有五个羟基的槲皮素表现出比山奈酚、芹菜素和木犀草素更强的抗氧化活性 本实验室前期对镉胁迫下地钱的生理响应研究表明,镉胁迫下雄性地钱中的脂质过氧化物丙二醛(MD A)含量、超氧化物歧化酶(S O D)和过氧化物酶(P O D)活性显著上调 因此,推测雄性通过上调黄酮醇与抗氧化酶共同抵抗氧化性损伤腺嘌呤和腺苷通过嘌呤代谢途径合成D NA或R NA同时,腺嘌呤经玉米素生物合成途径,由类异戊二烯取代N 位生成玉米素玉米素是细胞分裂素家族成员,通过促进细胞增殖分化参与植物生长发育,同时,细胞分裂素参与叶绿体发育和叶绿素生物合成,并具有保护叶绿素免受氧化降解的作用 对照组雌性地钱中腺嘌呤和腺苷含量显著高于雄性,经镉处理后,雌性中腺嘌呤和腺苷含量显著下降,雄性中AMP和肌苷含量显著上升玉米素生物合成和嘌呤代谢水平在雌性中下调而在雄性中上调对地钱响应镉胁迫的转录组性别差异研究表明,响应镉胁迫的植物激素信号转导通路在雌性中下调而在雄性中上调,本研究结果从代谢层面证实了这一点研究表明,镉胁迫降低了黑麦草(L o l i u mp e r e n n e)中细胞分裂素生物合成基因的表达,玉米素含量显著降低,腋芽的生长受抑 制 砷(A s)胁 迫 下 拟 南 芥(A r a b i d o p s i st h a l i a n a)中的细胞分裂素水平降低,由此增强了硫醇生 物合成基因的 表达,累积 包括谷胱甘 肽(G S H)在内的硫醇化合物以固存A s 前期的生理响应研究也发现,镉胁迫下雌雄地钱中G S H含量地均显著上调,且处理 d后雌性的G S H显著高于雄性 因此,结合代谢组研究结果,推测雌性地钱通过下调玉米素合成水平,诱导G S H的合成以响应镉胁迫但重金属胁迫下,植物中细胞分裂素水平对G S H的合成并不总是呈负效应如在绿藻(C h l o r e