海洋寡糖酶法制备研究进展.pdf
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1、杨子祥,李金梦,宋琨燕,等.海洋寡糖酶法制备研究进展 J.食品工业科技,2023,44(18):458467.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100075YANG Zixiang,LI Jinmeng,SONG Kunyan,et al.Research Progress on Preparation of Marine Oligosaccharides by EnzymaticMethodJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):458467.(in Chinese with English
2、abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100075 专题综述 海洋寡糖酶法制备研究进展海洋寡糖酶法制备研究进展杨子祥,李金梦,宋琨燕,葛风茹,鄢烽,黄冰冰,张梦岩,巫小丹,刘玉环,郑洪立*(南昌大学食品学院,江西南昌 330047)摘要:海洋寡糖是海洋多糖降解得到的含两个至十个单糖残基的糖类化合物。相较于海洋多糖,海洋寡糖具有水溶性高、生物活性强、易于机体吸收等优点。海洋寡糖有抗肿瘤、抗氧化、降低胆固醇、免疫调节等生理活性,可以广泛应用于食品、医药等领域。本文综述了海洋多糖、海洋多糖酶法制备海洋寡糖和酶的催化机制,介绍了褐藻胶、壳聚糖和黄原胶三种
3、主要的海洋多糖,以及褐藻胶裂解酶的-消除作用机制、壳聚糖酶的置换机制和黄原胶降解酶的降解作用机制。对海洋多糖酶法制备海洋寡糖的不足开展了讨论和未来的发展趋势进行了展望,以期为海洋寡糖制备及应用提供理论依据。关键词:海洋多糖,海洋寡糖,酶法,催化机制,生理活性本文网刊:中图分类号:TS254.4 文献标识码:A 文章编号:10020306(2023)18045810DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100075ResearchProgressonPreparationofMarineOligosaccharidesbyEnzymaticMethodYANGZixi
4、ang,LIJinmeng,SONGKunyan,GEFengru,YANFeng,HUANGBingbing,ZHANGMengyan,WUXiaodan,LIUYuhuan,ZHENGHongli*(College of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)Abstract:Marine oligosaccharides,which are prepared by degradation of marine polysaccharides,are carbohydrate com-pou
5、nds composed of two to ten monosaccharide residues.Compared with marine polysaccharides,marine oligosac-charides have several advantages,such as higher water solubility,stronger biological activity,and easier absorption by thebody.Marine oligosaccharides have a series of physiological activities,suc
6、h as anti-tumor,antioxidation,lowering cho-lesterol,and immunomodulation.They can be widely used in food,medicine,and other fields.This paper summaries marinepolysaccharides,preparation of marine oligosaccharides from marine polysaccharides by enzymatic methods,and thecatalytic mechanism of the enzy
7、mes.Furthermore,three major marine polysaccharides(alginate,chitosan,and xanthan)andthe catalytic mechanism of the three enzymes(-elimination mechanism of alginate lyase,replacement mechanism ofchitosanase,and degradation mechanism of xanthan enzyme)are introduced.It is expected to provide a theoret
8、ical referencefor preparation and application of marine oligosaccharides,deficiencies and potential for future research of preparation ofmarine oligosaccharides from marine polysaccharides by enzymatic methods are discussed.Key words:marine polysaccharides;marine oligosaccharides;enzymatic method;ca
9、talytic mechanism;physiologicalactivities 海洋占地球总面积约 71%,海洋占地球全部水资源的 97%,海洋中生物资源丰富,种类繁多。海洋多糖是海洋生物资源中最主要的组成成分之一。由于海洋高盐、高渗透压、低温、低光照、寡营养、氧胁 收稿日期:20221010 基金项目:国家自然科学基金项目(22066016,21767017);江西省技术创新引导类项目(20212BDH81004);江西省重点研发计划项目(20192BBH80023);赣州市重点研发计划项目(202101124943)。作者简介:杨子祥(1997),男,硕士研究生,研究方向:食品加工,E
10、-mail:。*通信作者:郑洪立(1981),男,博士,副研究员,研究方向:微生物与食品发酵,E-mail:。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 迫的特殊环境,形成了结构新颖和功能独特的海洋多糖1。近年来,随着人们对海洋资源的研究不断深入,发现海洋多糖具有调节免疫、降血糖、抗病毒、抗肿瘤等多种生理活性,这使其越来越广泛地应用于食品、医药、化妆品等领域2。然而,由于海洋多糖分子量大、结构复杂,导致了海洋多糖溶解性能差,严重限制了其应用3。海洋寡糖,也叫海洋
11、低聚糖,是海洋多糖经过各种方法(物理法、化学法、酶法等)降解得到的直链或支链低度聚合糖,通常由 210 个单糖单元组成。较海洋多糖,海洋寡糖具有溶解性能好、生理活性高、更具多样性等优势,是二十一世纪糖类研究的热点。由于海洋寡糖原料海洋多糖结构和组成的多样性,外加海洋寡糖有不同的制备方法,故海洋寡糖结构和生理活性更具多样性4。海洋寡糖具有抑制肿瘤、抗氧化、免疫调节等生理活性,安全无毒,溶解性能好,广泛应用于食品、农业、医药等领域5。海洋寡糖具有糖醇类似的功能性甜味,且热量较低,可用作食品甜味剂。此外,海洋寡糖难以被人体消化,可满足糖尿病患者的需要。海洋寡糖是一种新型益生元,具有改善肠道微环境的作
12、用6。海洋寡糖因具有促进植物生长、增强植物抗逆性、防治病害等作用,被广泛应用到农业生产中。海洋寡糖可以通过刺激和激活宿主细胞的免疫功能,增强机体对肿瘤细胞生长的调控,从而实现抗肿瘤的作用7。海洋寡糖的生物活性主要与其分子结构相关,分子结构主要受海洋多糖的种类、海洋寡糖制备方法、制备海洋寡糖的酶等因素影响,而制备结构新颖、聚合度明确的海洋寡糖,对于海洋寡糖的应用具有重要意义。本文综述了海洋多糖、海洋多糖酶法制备海洋寡糖和酶的催化机制,介绍了褐藻胶、壳聚糖和黄原胶三种主要的海洋多糖及褐藻胶裂解酶、壳聚糖酶和黄原胶降解酶的作用机制,并指出其存在的问题及今后的研究重点,以期为海洋寡糖制备及其应用提供理
13、论依据。1海洋多糖海洋多糖种类繁多(表 1),包括海藻多糖、海洋动物多糖和海洋微生物多糖等8。海藻多糖是广泛存在于海带、马尾藻、昆布等植物中的天然活性多糖,多具有高粘度或凝固能力。海洋动物多糖是指海洋动物(虾、贝类、螃蟹、鲨鱼、海参等)中的多聚糖及酸性粘多糖,主要包括壳聚糖、糖胺聚糖、硫酸软骨素等。海洋微生物多糖是指海洋中的微生物代谢的多糖,分为胞外多糖、胞壁多糖和胞内多糖。我国海洋多糖资源丰富,已广泛应用于各领域,如褐藻胶作为增稠剂、分散剂、乳化剂等应用于工业生产中9。随着越来越多海洋多糖资源的发掘以及海洋生物技术的发展,如利用工程细菌发酵生产海洋多糖,将不断丰富海洋多糖资源。众多的海洋多糖
14、为海洋寡糖的制备提供了丰富的原料资源10。生产寡糖较多的海洋多糖原料有黄原胶、壳聚糖、琼脂、卡拉胶、褐藻胶、岩藻聚糖等。我国是世界最大的褐藻胶(海藻酸钠)生产国11,壳聚糖是地球上年产量仅次于纤维素的天然高分子化合物12,黄原胶是目前世界上生产规模最大的微生物多糖13,故本文选取褐藻胶、壳聚糖和黄原胶为代表性海藻多糖、海洋动物多糖和海洋微生物多糖进行研究。表 1 海洋多糖Table 1 Marine polysaccharides多糖种类多糖名称来源参考文献海藻多糖褐藻胶海带、马尾藻等14褐藻糖胶裙带菜、昆布等15琼脂石花菜、江蓠等15卡拉胶角叉菜、鹿角菜等15海洋动物多糖壳聚糖虾、贝类、螃蟹
15、等16硫酸软骨素鲨鱼、乌贼等5,7岩藻聚糖硫酸酯海参5,17海洋微生物多糖胞外多糖海绵共附细菌18甘露聚糖爱德华氏细菌18黄原胶假黄单胞菌19 1.1褐藻胶褐藻胶又叫褐藻酸,分子量介于 20250 kDa 之间20。褐藻胶是广泛存在于海带、巨藻、马尾藻等褐藻细胞壁和细胞质间的一种海藻多糖,在天然状态下主要以游离酸、一价盐和二价盐的形式存在。-D-甘露糖醛酸(M)和-L-古洛糖醛酸(G)以 14 糖苷键构成线性多糖即为褐藻胶20。以上线性多糖有均聚甘露糖醛酸(PM)、均聚古罗糖醛酸(PG)和杂聚物(PMG)三种排列方式21(图 1)。这两种糖醛酸的比例因褐藻种类的不同而有很大差异,这种结构的多样
16、性可能是由于褐藻对环境或生理条件的功能适应性23。早在 1881 年,英国的化学家 Stanford 首次在褐藻中发现并成功分离出褐藻胶24。目前市售的褐藻酸钠(又叫海藻酸钠)是以海带等为原料,采用稀碱溶液提取法制备得到。褐藻酸钠具有抗氧化性、抑菌性、抗肿瘤、降胆固醇等生理活性,用作食品添加剂、医学领域的支架材料、农药化肥增效剂等2527。褐藻中褐藻胶的含量最高可达藻体干重的 40%28。褐藻胶为亲水性分子,褐藻酸与碱金属离子生成褐藻酸盐,易溶于水。褐藻胶的溶解性受 PM、PG 和 PMG的排列方式、M/G 的比例、溶液离子强度、pH 等的影响21,23。褐藻胶为酸不溶性,在 pH 低于 3
17、时,会转变为褐藻酸而析出23。1.2壳聚糖壳聚糖是一种广泛存在于虾、螃蟹、贝壳等海洋节肢动物的甲壳以及海洋软体动物的壳和骨骼中的海洋动物多糖,纯天然有机大分子,是甲壳素脱去乙酰基而成。壳聚糖也是目前大自然中发现的独一无二带正电荷的大分子碱性多糖29。它的基本糖单元为氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖(图 2),起连接作用第 44 卷 第 18 期杨子祥,等:海洋寡糖酶法制备研究进展 459 的键为-1,4-糖苷键。壳聚糖的单体为-(14)-2-氨基-2-脱氧 b-d-葡聚糖和-(14)-2-乙酰氨基-2-脱氧-b-d-葡聚糖,分子量介于 101 000 kDa 之间;壳聚糖溶于稀酸,不溶于水和有机溶剂
18、;壳聚糖在稀酸中的溶解性与其脱乙酰度呈正相关30。它的表面含有大量的氨基、羟基等活性基团,可以发生烷基化、酰基化、羧基化等多种化学反应,能与碳水化合物等阴离子或高分子化合物形成具有不同性能的壳聚糖衍生物。壳聚糖有免疫调节31、防治高血压32、抗肿瘤33等生理活性,可自然降解,已在食品、医疗等领域产业化应用。OHONH2OHHOOOHOOHNH2OONH2OHHOOHn图 2 壳聚糖的结构式30Fig.2 Structural formula of chitosan30 1.3黄原胶黄原胶,又称为黄胶、汉生胶。它是海洋微生物代谢的一种水溶性胞外多糖。黄原胶分子(图 3)是由 D-葡萄糖、D-甘露
19、糖和 D-葡糖醛酸组成。以上三种成分按 2:2:1 组成相对分子量在 1000 kDa 以上的天然有机高分子化合物19。黄原胶一级结构含葡糖基主链和三糖单位的侧链,葡糖基主链与纤维素主链结构相同,即-1,4-糖苷键连接两分子 D-葡萄糖;1 分子 D-葡糖醛酸和 2 分子 D-甘露糖在侧链中交替排列,与主链相连的甘露糖在 C-6 处被乙酰化,丙酮酸部分替代侧链末端的甘露糖,并以缩醛形式连接在 4-和 6-位置;其二级结构为双螺旋结构,在氢键作用下,侧链反向缠绕主链而形成;其三级结构为螺旋复合体,在共价键的作用下,由二级结构基础上形成,正因这种特殊的化学结构,使黄原胶溶液具有良好的耐盐性、耐酸耐
20、碱性、协同凝胶特性、独特的流变性等13。因此,黄原胶作为增稠剂、稳定剂等在食品工业、医药行业等大范围使用。黄原胶是目前世界上生产规模最大的微生物多糖13。2酶法制备海洋寡糖海洋寡糖的制备方法主要有化学法、物理法和生物酶法(表 2)。化学法是通过化学催化剂如草酸、过氧化氢、氢氧化钠等催化海洋多糖生成寡糖的方 OHOOHOOCOOHOHOOCOOHOHOOCOnHOOHHOaOOOHOHHOOCOHOOCOHOHOOOHHOOCOHnOObOHOHOOCHOOOOOHHOOCOHOOHOHOOCHOOOHHOOCOHOOnc图 1 褐藻胶的结构式22Fig.1 Structural formula
21、 of alginate22注:a:均聚甘露糖醛酸(PM);b:均聚古罗糖醛酸(PG);c:杂聚物(PMG)。HOOCCOOHOOOOOOOOOOOOOOHOHOHOHOHOHnOHHOCH2OAcCH2OHCH2OHOHCH2H3C图 3 黄原胶的结构式13Fig.3 Structural formula of xanthan gum13 460 食品工业科技2023 年 9 月法,化学法应用广泛,操作简便,是一种成熟的方法。但它存在化学催化剂污染环境、反应条件剧烈、副产物量大等缺点3436。物理法(微波辐射、紫外线照射、高温高压等)操作简便、不需要催化剂,但存在降解效率低下、海洋寡糖得率低
22、等问题3739。生物酶法条件温和、酶专一性强、海洋寡糖得率高、不产生副产物、环境友好,是制备海洋寡糖的有效方法4042。早期生物酶法制备海洋寡糖以游离酶法为主,目前生物酶法制备海洋寡糖主要采用固定化酶法。游离酶法和固定化酶法通常均采用单一酶,而不是复合酶4046。当前酶法制备得到的海洋寡糖主要有:壳寡糖6、褐藻胶寡糖7,9,35、卡拉胶寡糖、黄原胶寡糖、琼胶寡糖等42。表 2 海洋寡糖制备方法Table 2 The preparation methods of marine oligosaccharides制备方法优点缺点参考文献物理法操作简单、试剂用量少降解率低3436化学法技术成熟、成本低
23、腐蚀设备、污染环境3739游离酶法条件温和、绿色高效成本高、稳定性差、酶不可重复利用4043固定化酶法稳定性高、产品收率高、酶可重复使用酶活力低、只适用于小分子底物4446 2.1游离酶法制备海洋寡糖游离酶法制备海洋寡糖是以海洋多糖为原料。海洋多糖种类众多,而酶催化具有高度专一性,故制备海洋寡糖的酶种类众多;包括一类是降解特定的海洋多糖如褐藻胶裂解酶、壳聚糖酶、黄原胶降解酶、卡拉胶酶、琼胶酶等,另一类降解非特定的海洋多糖,如:淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、甘露糖酶等,以上酶主要来自微生物。酶法制备海洋寡糖始于上世纪 50 年代中后期,其目的主要是为了研究海洋寡糖的结构与构效关系以开发药物
24、和功能性制品。经过多年的发展,利用游离酶制备海洋寡糖已经取得了显著进展;特别在新酶的发现、酶结构、性质与功能的解析、酶的改造、酶催化条件的优化等方面做了大量的研究4041,47。不同酶作用于不同的海洋多糖,其反应条件和产物不同。Falkeborg 等27利用-褐藻胶裂解酶催化 5%褐藻酸钠,反应条件:酶用量 5%、温度 35、pH7.0、酶解时间 48 h,产物为聚合度不大于 4 的寡糖。季珂等48以壳聚糖酶催化 1%壳聚糖,反应条件:酶用量 120 U/g、温度 50、pH6.0、酶解时间4 h,制备得到的寡糖聚合度不大于 4。谷金芸等49以黄原胶降解酶催化 2 mg/mL 的黄原胶,酶解条
25、件:酶用量 1 mg/mL、温度 45、pH8.0、酶解时间 2 min,得到了黄原胶寡糖聚合度为 718。同一酶,但不同类型,催化产物也不相同。-褐藻胶裂解酶和双功能褐藻胶裂解酶 AlySY08 制备得到的寡糖聚合度不同。Li 等50利用双功能褐藻胶裂解酶 AlySY08 催化 0.3%褐藻胶,酶解条件:酶用量 21.5 U/mg、温度40、pH7.6、酶解时间 8 h,所制备的寡糖聚合度不大于 5,寡糖得率超过 80%。游离酶法虽然降解效率高、可制得低分子量的海洋寡糖,但存在酶无法重复利用、易失活以及在均相催化中与底物/产物难以分离等缺点,导致其生产成本提高,使游离酶法制备海洋寡糖在工业生
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