非病毒纳米载体递送CRISPR_Cas9的研究进展.pdf
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1、DOI:10.16605/ki.1007-7847.2022.07.0169非病毒纳米载体递送 CRISPR/Cas9 的研究进展收稿日期:2022-07-12;修回日期:2022-11-12;网络首发日期:2023-03-15基金项目:湖南省发育生物学与生物育种优势特色学科群交叉研究项目(2022XKQ0205);湖南省教育厅科学研究重点项目(18A028);湖南省卫生健康委员会重点项目(202201065690);湖南省普通高等学校教学改革研究项目(HNJG-2020-1286);湖南师范大学基层教学组织建设项目(202101003015)作者简介:吕丹(1994),女,湖南衡阳人,硕士研
2、究生,主要从事分子发育遗传学研究;*通信作者:叶湘漓(1970),男,湖南长沙人,教授,硕士生导师,主要从事人类心脏发育及其心血管疾病相关基因的筛选及功能研究,E-mail:ye_。吕丹1,2,谭志霞1,2,3,许龙1,吴秀山2,叶湘漓1,2*(1.湖南师范大学 医学院,中国湖南 长沙 410003;2.湖南师范大学 生命科学学院 心脏发育研究中心,中国湖南长沙 410081;3.长沙市第九医院,中国湖南 长沙 410004)摘要:成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白 9(clustered regularly interspaced short palindromic re-peat/C
3、RISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)技术目前广泛应用于生命医学领域的基础研究及临床应用研究。由于载体在 CRISPR/Cas9 技术中发挥了重要的作用,如何进一步开发和优化载体系统具有重要的意义。传统的载体大多以病毒载体为主,其递送的效率高,但亦存在插入片段的大小有限、免疫反应、致癌、难以大规模生产甚至脱靶等缺陷;而非病毒纳米载体在一定程度上可解决基因编辑过程中由病毒载体所带来的潜在毒性和容量限制等问题,可能具有更广阔的应用前景。本文主要综述了目前用于 CRISPR/Cas9 系统递送的非病毒纳米载体,探讨了非病毒纳米载体在递送 CRISPR/Cas9
4、 系统时可能遇到的主要困难,提出了相应的解决方案和策略,以期为基因治疗和药物研发提供新的参考依据。关键词:成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白 9(CRISPR/Cas9);非病毒纳米载体;病毒载体;基因编辑;基因治疗中图分类号:Q78文献标志码:A文章编号:1007-7847(2023)04-0371-06Research Progress on Non-viral Nanocarrier Delivery of CRISPR/Cas9L譈 Dan1,2,TAN Zhixia1,2,3,XU Long1,WU Xiushan2,YE Xiangli1,2*(1.College of Me
5、dicine,Hunan Normal University,Changsha 410003,Hunan,China;2.The Center for Heart Development,College of Life Sciences,Hunan Normal University,Changsha 410081,Hunan,China;3.Changsha Ninth Hospital,Changsha410004,Hunan,China)Abstract:Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-ass
6、ociated protein 9(CRISPR/Cas9)technology is currently widely used in both basic and clinical application research of medicine.Sincevectors play an important role in CRISPR/Cas9 technology,further developing and optimizing vector systemsis of great significance.Most of the traditional vectors are vir
7、al vectors,which have high delivery efficiency,but with defects such as limited insert size,induction of immune response,carcinogenicity,difficulty in large-scale production and even off-target.Non-viral nanocarriers can solve,to some extent,the potential toxicityand capacity limitations caused by v
8、iral vectors during gene editing,and may have broader application pros-pects.This paper reviews the non-viral nanocarriers currently used for CRISPR/Cas9 system delivery,inclu-ding main difficulties that non-viral nanocarriers may encounter in delivering CRISPR/Cas9 systems,and cor-responding soluti
9、ons and strategies,in order to provide a new reference for gene therapy and drug development.Key words:clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9(CRISPR/Cas9);non-viral nanocarrier;viral vector;gene editing;gene therapy(Life Science Research,2023,27(4):371-3
10、76)第 27 卷 第 4 期生命科学研究灾燥造援27 晕燥援4圆园23 年 8 月蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 砸藻泽藻葬则糟澡Aug.圆园23窑 技术与应用 窑生命科学研究圆园23 年成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白 9(clustered regularly interspaced short palindro-mic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统是近年来生命医学领域最重要的革命性技术之一,它能够精确地改变生物体的 DNA,对于寻找各种疾病(如癌症、艾滋病等)的新疗法以及培育植物新品种等具有划时代的意义1。不过,如
11、何将 CRISPR/Cas9 系统有效地递送至靶细胞仍然是一个难题,目前人们主要采用病毒载体和非病毒纳米载体两种方式进行递送2。病毒载体(如慢病毒、腺病毒等)属于最早被开发的递送技术,兴起于 20 世纪 90 年代,其递送的效率高,但存在潜在的免疫原性、插入突变以及较高的脱靶效应等风险,这限制了其进一步应用3-4。非病毒纳米载体,如脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle,LNP)、聚合物纳米颗粒(polymeric nanoparticle,PNP)、金纳米颗粒(gold nanoparticle,Au-NP)、生物膜类纳米粒子的细胞外囊泡(extracellular vesicl
12、e,EV)等,则可能有效地解决病毒载体带来的潜在毒性及容量限制等问题,且具有简单易得、成本较低、安全等优点,使基因编辑技术具备了更加广阔的应用前景5-6。1非病毒纳米载体的主要类型1.1脂质纳米颗粒脂质纳米颗粒是目前最有效的非病毒纳米载体递送系统之一,目前几种脂质载体已被批准用于基因治疗的临床试验7。脂质纳米颗粒将带有供体物质的 CRISPR/Cas9 系统递送到体内,能有效地保护供体物质不被降解8。CRISPR/Cas9 的基因编辑可以通过质粒 DNA、RNA 和蛋白质来实现,这些形式均可有效地封装到脂质纳米颗粒中。通常,单链向导 RNA(single guide RNA,sgRNA)是带负
13、电荷的,而 Cas9 蛋白带正电荷;带负电的 CRIS-PR 被阳离子脂质吸引形成脂质纳米颗粒;脂质层不但可以帮助 CRISPR 成分穿过细胞膜,还可以使其免受核糖核酸酶的降解和免疫反应的干扰9。现阶段,阳离子脂质递送系统已广泛应用于生物大分子,如质粒 DNA、mRNA 和干扰小 RNA(small interfering RNA,siRNA)。商业化出售的脂质纳米颗粒是一种成熟的递送载体,如 Lipofectami-neTMRNAiMAX 以及脂质体 Lipofectamine 2000,它们可以与多种细胞系结合,并可用于基因治疗或基因敲除模型的建立10。有研究利用以阳离子脂质为基础的递送机
14、制,将带有负电荷的 Cas9 核糖核蛋白(Cas9 ribonucleoprotein,Cas9 RNP)与Li-pofectamine 2000 共同孵育,随后递送至人骨肉瘤细胞系 U2-OS,发现即便在血清干扰的情况下,内源性绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的敲除率仍可达 80%11。然而,阳离子脂质纳米颗粒主要通过内吞作用进入细胞,很容易在内体-溶酶体中被捕获和降解,进而降低转染效率。有研究显示,加入新型 pH 响应性荧光内体破坏表面活性剂(fluorescent endosomal disruptive sur-factant,FEDS)可
15、提高基于脂质纳米颗粒的 Cas9RNP 递送效率,因为它可以破坏内体并识别已转染的细胞;而且,将 FEDS 掺入 Lipofectamine/Cas9-RNP 复合物中,可使荧光富集和内体的破坏相结合,让标记有 GFP基因的人胚肾细胞(HEK 293T-GFP)的编辑效率提高至 3 倍以上12。此外,Wang 等13将具有生物还原性的脂质纳米颗粒(bioreducible lipid nanoparticle,BLN)与负增压 Cre 重组酶或 Cas9 RNP 相结合,以驱动非病毒纳米载体的静电组装,从而介导基因编辑的有效递送。这些 BLN 可有效地将供体蛋白质递送至细胞内,并增强供体物质的
16、内体逃逸功能,从而确保供体物质无误地递送至体内特定的靶位点。而且,这种与 BLN 复合的增压 Cre 蛋白和Cas9 RNP 被递送到宿主细胞内后,可以实现70%以上的基因编辑有效率。1.2聚合物纳米颗粒与脂质纳米颗粒相比,聚合物纳米颗粒可穿过细胞膜有效地保护供体物质免受酶的降解14。此外,聚合物纳米颗粒亦因其高度生物相容性和设计的灵活性,被广泛应用于 CRISPR/Cas9 系统的体内递送15-16。其中,常见的有树枝状大分子聚酰胺-胺(polyamindoamine,PAMAM)和壳聚糖(chi-tosan,CS)。PAMAM 是一类具有超支化结构和高密度表面官能团的合成聚合物。为了确保
17、Cas9 RNP 与PAMAM 的有效结合,有研究者利用高密度苯硼酸在 PAMAM 的表面进行功能化处理17。所用的高密度苯硼酸是一种缺电子基团,通过氮-硼酸盐结合后,可有效地与蛋白质的胺基和咪唑基团相互作用,由此富含苯硼酸的 PAMAM 可以和不同等电点的蛋白质结合并产生均匀的非病毒纳米载体,其通过与 Cas9 RNP 结合可以有效地将供体物质递送到不同的细胞类型,并在不同的靶细372第 4 期吕丹等:非病毒纳米载体递送 CRISPR/Cas9 的研究进展胞内显示出较高的编辑效率17。CS 是一种丰富的天然阳离子聚合物,主要由甲壳素通过脱乙酰衍生的纤维素基生物聚合物组成,具有可再生性、生物降
18、解性、生物相容性、无毒性,且对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌及真菌具有广泛的抗菌活性,因而成为基因转移和药物递送最有效的天然非病毒纳米载体之一18-19。Liu等20设计了双靶向聚合物/无机杂化纳米粒子,并利用共沉淀的方式将周期蛋白依赖性激酶 11(cyclin-dependent kinase 11,CDK11)基因的敲除质粒封装到由硫酸鱼精蛋白、碳酸钙、磷酸钙和羧甲基壳聚糖等组成的纳米递送核心中;由于核酸适配体的静电作用,这种双靶向聚合物系统可以将CRISPR/Cas9 质粒递送至肿瘤细胞内,并有效地敲除 CDK11 基因,即 CS 通过灵活的结构设计,并与 CRISPR/Cas9 系统一起制
19、备,可达到理想的基因编辑效果。此外,有研究还利用新型苯硼酸官能化壳聚糖-聚乙烯亚胺(chitosan-polyethylenimi-ne,CS-PEI)载体递送 CRISPR/Cas9 系统,以通过口服给药来降低胆固醇的含量21,这种苯硼酸功能化的设计旨在增强药物在靶细胞内的稳定性,人工优化后的 CS-PEI 多聚物配方实现了对靶蛋白的表达量下调,并首次证明了通过口服给药的方式进行全身性基因编辑的可行性,这为日后开展无创性药物治疗提供了新的思路。1.3金纳米颗粒金纳米颗粒是一种新型的可用于 Cas9 RNP体内递送的载体。与脂质纳米颗粒不同的是,该载体通过 Au-S 键很容易将金纳米颗粒与含巯
20、基物质交联,在组装和分布上易于控制22。目前,成人大脑中的基因编辑主要是利用传统的病毒载体方式递送关键基因,但由于病毒载体的潜在毒性,基因编辑效果往往欠佳。因此,开发较为安全的非病毒纳米载体用于大脑的基因编辑很有必要。有研究报道,CRISPR-Gold(一种金纳米颗粒载体)可能能够更有效且安全地编辑成年小鼠大脑中的基因,人们可通过颅内注射 CRISPR-Gold 的方式递送供体物质以编辑成年小鼠大脑中的基因,如:利用 CRISPR-Gold 递送 Cas9 和 Cpf1-RNP 复合物,可有效编辑大脑中的大部分细胞,包括神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞,安全且毒性小23。此外,CRISPR-
21、Gold 还被用于小鼠代谢型谷氨酸受体 5 基因(mGluR5)敲除模型的建立,即将敲除该基因的供体物质通过 CRISPR-Gold 递送至颅内可有效地敲除 mGluR5 基因;进一步的研究发现,颅内 mGluR5 基因的敲除减少了小鼠脆性 X 综合征(一种单基因神经发育疾病,mGluR5基因可能调控了该疾病的神经元连接)的神经表型重复行为23-24。上述研究表明,通过 CRISPR-Gold的非病毒纳米载体的递送方式,成年小鼠大脑的基因编辑可以将小鼠从神经行为缺陷中拯救出来,并使局灶性脑敲除动物模型的快速构建成为可能。1.4细胞外囊泡细胞外囊泡源于大多数细胞类型的纳米级膜囊泡,是外泌体、微囊
22、泡和凋亡小体的总称,可携带多种生物大分子并参与细胞间通信。细胞外囊泡是一种天然的内源性非病毒纳米载体,具有生物相容性高、免疫原性低及稳定性高等优点,是目前最具发展前景的递送载体之一25-26。Luo 等27利用外泌体作为递送载体,将带有供体成分的CRISPR/Cas9 系统应用于小鼠肝脏的抗纤维化治疗:首先,将 Cas9 的失活变体(dCas9)融合到 VP64反激活子结构域,以位点特异性激活的方式介导基因表达;其次,将 dCas9-VP64 融合基因和靶向肝细胞核因子 4a(hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4a;一种导致肝脏纤维化的基因)的 sgRN
23、A 以质粒 DNA 的形式转染到小鼠生殖细胞中;再次,从生殖细胞中分离外泌体,并将其与小鼠肝脏纤维化相关的肝星状细胞孵育,从而诱导表达 HNF4a的肝星状细胞转变成肝细胞样细胞,结果显示小鼠的肝纤维化表型得到一定缓解。2非病毒纳米载体递送 CRISPR/Cas9 的关键障碍对于 CRISPR/Cas9 系统而言,当前紧要的任务是设计一种高效且安全的递送载体。由于生理条件下屏障难度的增加,且用于递送 CRISPR/Cas9 系统的非病毒纳米载体会与细胞相互作用,CRISPR/Cas9 的体内有效递送并非易事。现有的非病毒纳米载体相比于病毒载体有明显的优势,但仍然存在一些困难。2.1封装尺寸通常,
24、Cas9 蛋白、mRNA 和 DNA 的尺寸大小以及不同的电荷性质会严重影响 CRISPR/Cas9 系统在递送载体中的有效封装28-29。常用的 Cas9 蛋白源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes),即SpCas9,其分子质量约为 160 kD,比大多数蛋白质大。此外,Cas9 蛋白带正电荷,而常规的蛋白质373生命科学研究圆园23 年带负电荷,因此,阳离子脂质纳米颗粒或者聚合物纳米颗粒可用于封装带有负电荷的蛋白质,而不能用于递送 Cas9 蛋白的天然形式。与蛋白质相似,Cas mRNA 和 DNA 具有较大的尺寸,这也增加了封装的难度。尽管来自金黄色葡萄球菌(St
25、aphy-lococcus aureus)的 Cas9,即 SaCas9,因比 SpCas9 小而得以使用,但整体尺寸还是太大,不利于CRIS-PR/Cas9 的体内递送。因此,在未来的非病毒纳米载体的设计中研究者必须考虑到封装尺寸问题。2.2宿主的免疫原性由于外源性质粒 DNA、RNA 和蛋白质分子具有免疫原性,所以它们一旦递送至体内很可能会引发宿主的免疫反应。通常来说,将带有供体物质的 CRISPR/Cas9 系统封装到非病毒纳米载体后,宿主的免疫识别能力在一定程度上有所降低,即 CRISPR/Cas9 系统会受到非病毒纳米载体的保护,这将显著降低机体的免疫识别以及免疫清除作用。但需要注意
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