贵州省野生皂荚资源遗传多样性研究.pdf
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1、DOI:10.11929/j.swfu.202205028引文格式:田红红,杨菊,王彪,等.贵州省野生皂荚资源遗传多样性研究 J.西南林业大学学报(自然科学),2023,43(5):3946.贵州省野生皂荚资源遗传多样性研究田红红1,2杨菊1,2王彪1,2王秀荣1罗敬3赵杨1,2(1.贵州大学林学院,贵州贵阳550025;2.贵州省森林资源与环境研究中心,贵州贵阳550025;3.贵州省林业种苗站,贵州贵阳550025)摘要:为探究皂荚资源的遗传多样性,采用相关系列扩增多态性(SRAP)分子标记技术对贵州省14 个皂荚天然群体的 203 份样品进行了遗传多样性研究;通过聚类分析,探讨皂荚群体间
2、 Neis 遗传一致度、遗传距离分别与地理距离的相关性。结果表明:10 对 SRAP 引物共扩增出 77 条清晰条带,多态性比例为 98.70%;筛选出的 SRAP引物组合具有较好多态性,可用于皂荚的遗传多样性分析;观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon 信息指数(I)和 Neis 遗传多样性指数分别为 1.7922、1.5613、0.4633 和 0.3174,皂荚居群间遗传分化系数(Gst)为 0.2530,基因交流值(Nm)为 1.4764,居群间存在较强的基因流,分化较小;群体遗传距离在 0.05040.3596 之间,平均值为 0.162,地理距离与遗传距离呈
3、显著正相关。14 个群体可分为 4 个类群;其中黔南福泉单独作为一个类群。关键词:皂荚;相关系列扩增多态性;引物;遗传多样性中图分类号:Q943文献标志码:A文章编号:20951914(2023)05003908StudyonGeneticDiversityofWildGleditsia sinensisResourcesinGuizhouProvinceTianHonghong1,2,YangJu1,2,WangBiao1,2,WangXiurong1,LuoJing3,ZhaoYang1,2(1.CollegeofForestry,GuizhouUniversity,GuiyangGuiz
4、hou550025,China;2.GuizhouProvincialForestResourcesandEnvironmentResearchCenter,GuiyangGuizhou550025,China;3.ForestrySeedlingStationinGuizhouProvince,GuiyangGuizhou550025,China)Abstract:ToexplorethegeneticdiversityofGleditsia sinensis.Thegeneticdiversityof203samplesfrom14naturalpopulationsofG.sinensi
5、sinGuizhouProvincewasstudiedbyusingrelatedseriesamplifiedpolymorph-ism(SRAP)molecularmarkertechnology.ClusteranalysiswasusedtoexplorethecorrelationofNeisgeneticidentityorgeneticdistanceandgeographicaldistanceamongG.sinensispopulations.Theresultsshowedthat77clearbandswereamplifiedby10pairsofSRAPprime
6、rs,andthepolymorphismratiowas98.70%.TheselectedSRAPprimercombinationhadgoodpolymorphismandcouldbeusedforthegeneticdiversityanalysisofG.sin-ensis.Thenumberofobservedalleles(Na),effectivenumberofalleles(Ne),Shannoninformationindex(I)andNeisgeneticdiversityindexwere1.7922,1.5613,0.4633and0.3174.Thegene
7、ticdifferentiationcoefficient(Gst)amongtheG.sinensispopulationswas0.2530,andthegeneexchangevalue(Nm)was1.4764.Therewasstronggeneflowamongthepopulations,andthedifferentiationwassmall;thepopulationgeneticdistancesrangedfrom0.0504to0.3596,withanaverageof0.162.Geographicaldistanceswerepositivelycorrelat
8、edwithgeneticdis-tances.Clusteranalysisshowedthatthe14groupscouldbedividedinto4groups;amongthem,FuquaninQian-收稿日期:20220509;修回日期:20221026基金项目:贵州省科技计划项目(黔科合支撑 20201Y056 号,黔科合支撑 2022 一般 102)资助。第 1 作者:田红红(1996),女,硕士研究生。研究方向:植物资源调查与评价。Email:。通信作者:赵杨(1974),男,教授,博士生导师。研究方向:植物资源挖掘、种质改良及评价。Email:。第43卷第5期西南林业
9、大学学报Vol.43No.52023年9月JOURNALOFSOUTHWESTFORESTRYUNIVERSITYSep.2023nanwasregardedasagroupalone.Key words:Gleditsia sinensis;SRAP;primer;geneticdiversity皂荚(Gleditsia sinensis)是豆科(Legumino-sae)苏木亚科(Caesalpinioideae)皂荚属(Gled-itsia)植物,喜光耐旱,适应性强,分布广,集药用、食用、化工、用材、观赏于一体,是优良的多功能生态经济型树种。作为贵州省重要的特色经济林木,皂荚少量散生分布
10、于“四旁”,且处于严重的片段化状态,多以成树为主。目前全国利用的皂荚原材料多来自于天然野生皂荚,人工栽植的较少,群体遗传多样性保存面临严峻的挑战1。相关序列扩增多态性(SRAP)是基于 PCR的分子标记,无需任何序列信息即可直接进行PCR 扩增,通过独特的双引物设计,检测基因组中的开放阅读框的多态性2。相比于其他分子标记,SRAP 分子标记具有技术难度低,可靠性高和重复性好等诸多优点3,如使用 SRAP 和 IS-SR 分子标记分别对洋葱(Alium cepa)资源进行遗传多样性分析,发现 2 种分子标记的聚类结果基本一致,但相比于 ISSR 分子标记,SRAP 分子标记能检测更多的基因位点4
11、。可见,SRAP 分子标记在遗传多样性分析方面的优势。现在 SRAP分子标记已广泛运用于蚕豆(Vicia faba)5、酸豆(Tamarindus indica)6和任豆(Zenia insig-nis)7等豆科植物的遗传多样性研究中。近年来,对皂荚资源的相关研究主要集中在表型性状多样性8、皂荚刺的药理作用9、繁殖与苗期栽培以及抗性育种等方面的研究10。对于皂荚遗传多样性的研究也有相关报道;如 Li 等11利用 SSR 分子标记对皂荚进行微卫星定位并且利用 5 对引物成功鉴别皂荚雌株和雄株。张安世等12、范定臣等13利用 RSAP 分子标记技术以及SCoT 分子标记技术分别筛选出 17 对 R
12、SAP 引物、12 对 SCoT 引物对 18 份皂荚种质材料进行 PCR扩增,其多态性比率均超过 90%。李伟等14利用ALFP 分子标记研究中国南方 6 个省的 10 个皂荚天然群体的遗传多样性,发现群体内变异是中国南方皂荚变异的主要来源。林富荣等15使用转录组数据开发了 SSR 分子标记引物,在 9 个皂荚亲缘种之间具有良好的通用性。贵州省皂荚植物资源丰富,在全省各县市均有分布,作为皂荚野生资源分布区的贵州省正在以果(籽)用大面积种植,在 2018 年皂荚被列入贵州省特色经济林产业,特别是以毕节市为主的喀斯特石漠化地区为其主要种植区。SRAP 分子标记已广泛用于多种植物的遗传多样性分析,
13、但还未应用于贵州省野生皂荚资源的相关研究。因此,本研究对贵州省内的皂荚资源进行调查,对遗传多样性进行分析与评价,开展选育研究并建立种质资源库,可以为合理开发利用皂荚种质资源提供参考依据。1 材料与方法 1.1 试验材料2021 年 9 月在 14 个皂荚群体 203 份皂荚资源,采集当年生叶片,用锡箔纸保存,并标记编号,置于液氮中,带回实验室保存于80 冰箱,用于后续提取皂荚基因组 DNA。利用 GPS定位软件详细记录采集点的地理位置、气候条件(表 1)。表 1 贵州省皂荚群体叶片采集信息表Table1LeafcollectioninformationofG.sinensispopulatio
14、ninGuizhouProvince群体采集地点东经/()北纬/()海拔/m个体数A1安顺平坝106.2626.41119117A2安顺西秀105.9226.25124116A3贵阳花溪106.6826.43125025A4贵阳云岩106.7226.60125517A5黔东南凯里107.9726.5887435A6黔南福泉107.5226.6883422A7黔东南独山107.5525.3193411A8黔南长顺106.4526.02114226A9黔南都匀107.5226.269145A10黔南惠水106.2225.4111009A11黔西南兴义104.9025.0912537A12铜仁印江1
15、08.4127.997894A13铜仁万山109.2127.528993A14铜仁思南108.2527.949636 1.2 试验方法1.2.1叶片 DNA 的提取皂荚叶片 DNA 提取采用天根生化科技有限公司研发的新型植物基因组 DNA 提取试剂盒(DP320,中国),用 1%的琼脂糖凝胶电泳和超40西 南 林 业 大 学 学 报第43卷微量紫外分光光度计(NanoDrop2000,美国)进行皂荚基因组 DNA 浓度和纯度的检测。其中1%的琼脂糖电泳凝胶是较直观地显示 DNA 的提取结果,以明亮、无拖尾的单条带为最佳。Nano-drop 检测的结果可以较准确地反映出 DNA 的浓度与纯度,纯
16、度比较好的样品的 260/280 的值应该在 1.8 为好,比值小于 1.8,说明该 DNA 中可能存在蛋白质或酚类;样品 260/230 的比值应该大于 2.0,效果较好,当比值小于 2.0 时,说明可能存在盐离子和碳水化合物等物质的影响16。提取的皂荚 DNA样品稀释到 50ng/L 左右后放于20 冰箱保存。1.2.2SRAP 引物来源及筛选为了确保 SRAP 引物的扩增质量,本试验根据 Li 等3提出的原则,设计 SRAP 引物,将引物序列记录送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。根据正反引物序列可随机组成 169对 SRAP 引物,用于贵州省皂荚资源遗传多样性分析,对引物进行
17、琼脂糖凝胶电泳筛选验证。最终选择多态性好,条带清晰,扩增稳定的引物组合用于皂荚遗传多样性分析。1.2.3SRAPPCR 扩增体系及程序在引物筛选时不断调整与优化 SRAPPCR 的反应体系及 PCR 反应程序,得出了最优的皂荚SRAPPCR 反应体系为 ddH2O10.5L,上下引物各 0.5L,模板 DNA1L,以及 GreenTaqMix7.5L。SRAPPCR 反应程序:94(5min);94(1min);34(1min),5 个循环;72(1min),94(1min),50(1min),72(1min),30 个循环;72(10min),4 保存。1.2.4数据统计及分析根据凝胶电泳结
18、果,利用 GelProAnalyz-er 软件及人工辅助对数据进行判读,有条带记为“1”,无条带记为“0”,在 Excel 软件中形成01 矩阵。将该矩阵导入 POPGENE1.32 软件,计算以下遗传参数:多态位点百分率(PPB);观测等位基因数目(Na);有效等位基因数目(Ne);Shannon 多样性指数(I);观测杂合度(Ho);期望杂合度(He);Neis 标准遗传距离(GD)和遗传一致度(GI);基因流(Nm)。通过软件 GenAlEx6.503 计算 phipt 遗传分化系数。通过 NTSYSpc2.10e 软件,采取 UPGMA 聚类法得到聚类图。2 结果与分析 2.1 皂荚
19、SRAP 引物的筛选用 10 个来源不同的皂荚材料对随机组成的169 对 SRAP 引物进行初步筛选,结果表明有89 对引物能够成功扩增出目的条带(图 1)。在贵州省皂荚的 14 个群体中,每个群体随机选择3 个皂荚单株材料共 42 个进行 SRAPPCR 扩增试验,最终选取了 10 对通用性好、多态性高且条带清晰的 SRAP 引物用于贵州省皂荚资源遗传多样性研究,结果见表 2。MM500 bp100 bp500 bp100 bpM100bpDLMaker。图 1 引物 GSSP2 的筛选结果Fig.1ScreeningresultsofprimerGSSP2表 2 皂荚 SRAP 引物信息T
20、able2SRAPprimerinformationofG.sinensis引物正向引物序列(53)反向引物序列(53)退火温度/GSSP2TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGAC50GSSP33TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGAG49GSSP37GACTGCGTACGAATTAACGACTGCGTACGAATTAAT50GSSP5GACTGCGTACGAATTAGCTGAGTCCAAACCGGTAG55GSSP10TGAGTACAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGAG48GSSP22TGAGTCCAAACCGGA
21、TAGACTGCGTACGAATTGAG50GSSP23TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTGCC50GSSP25TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTAAT55GSSP40GACTGCGTACGAATTAACTGAGTCCAAACCGGTAG52GSSP9TGAGTACAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTCAC52第5期田红红等:贵州省野生皂荚资源遗传多样性研究41 2.2 皂荚群体遗传多样性分析皂荚 14 个群体的遗传多样性指数见表 3,检测到的 Na为 0.33841.8961,平均值为 1.7922,黔南福泉群体最大(
22、1.8961),黔南长顺群体最小(0.3384),有效等位基因数(Ne)是反映群体遗传变异大小的 1 个指标,其数值越接近所检测到的等位基因的绝对数,表明等位基因在群体中分布越均匀。其中,黔南福泉最高(1.5651),黔南长顺最低(0.3339),所以黔南长顺群体的等位基因在群体中的分布较其他种群来说较均匀。H 的观测值黔南福泉最高(0.3254),黔南长顺最低(0.1656)。I 反映的是位点的遗传多样性程度,I 的观测值为 0.22600.4824,14 个群体的排序大小依次为(由大到小):黔南福泉安顺平坝贵阳云岩黔东南凯里黔西南兴义安顺西秀贵阳花溪黔南惠水铜仁思南黔东南独山铜仁印江黔南都
23、匀铜仁万山黔南长顺。黔南福泉群体的多态位点比率最大(89.61%),铜仁万山群体的多态位点比率最小(42.56%)。黔南福泉群体的遗传多样性指标值都相对偏高,具有较好的适应能力与进化潜力。表 3 皂荚群体遗传多样性Table3GeneticdiversitybetweenG.sinensispopulations群体NaNeHI多态位点数多态位点比率/%A11.79221.56130.31740.46336179.22A21.80521.49470.29080.43366280.52A31.81821.48250.28510.42736381.82A41.84421.52830.31010.4
24、6206584.42A51.85711.51530.30320.45436685.71A61.89611.56510.32540.48246989.61A71.72731.40980.23780.35775672.73A80.33840.33390.16560.22606787.01A91.63641.37310.22430.33794963.54A101.72731.46780.26760.39565672.73A111.84421.50770.29770.44646584.42A121.57141.42610.23410.33964457.14A131.41561.29380.16610.
25、24323242.56A141.66231.45950.25910.37965166.23平均值1.79221.56130.31740.46336179.22 2.3 群体遗传分化分析Neis 基因分化系数表示总的遗传变异种群间变异所占的比例,是衡量种群遗传分化最常用的指标,用来表示亚群体间基因分化相对量的大小,其值越大代表群体间遗传分化程度越高,越小代表遗传分化程度越低。贵州省 203 份皂荚资源基因分化系数和基因流结果如下:皂荚群体Ht为 0.3688、Hs为 0.2755、Dst为 0.0933、群体内遗传多样性高于群体间;Gst为 0.253,基因流Nm为 1.4764,皂荚群体间的基
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