化学发光酶免疫分析法检测黄瓜、青菜和水中的噻虫嗪残留.pdf
《化学发光酶免疫分析法检测黄瓜、青菜和水中的噻虫嗪残留.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《化学发光酶免疫分析法检测黄瓜、青菜和水中的噻虫嗪残留.pdf(9页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、研究论文doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0053化学发光酶免疫分析法检测黄瓜、青菜和水中的噻虫嗪残留郭志慧1,2,宋天玮1,2,钱磊1,2,郑康1,2,操海群1,2,3,廖敏1,2,3,方庆奎*,1,2,3(1.安徽农业大学植物保护学院,合肥230036;2.安徽农业大学作物有害生物综合治理安徽省重点实验室,合肥230036;3.安徽农业大学农产品质量安全省级重点实验室,合肥230036)摘 要:为实现黄瓜、青菜和水样品中噻虫嗪残留的灵敏、快速检测,本文开展了噻虫嗪残留化学发光酶免疫分析(chemiluminescenceenzymeimmunoassay
2、,CLEIA)研究。通过优化抗原和抗体工作浓度,分析体系中封闭物种类、甲醇含量、钠离子浓度及 pH 值,建立了噻虫嗪化学发光酶免疫分析方法。在最优分析条件下,该方法的线性范围为 0.12512.5ng/mL,定量限(LOQ)为 0.125ng/mL,IC50值为 1.01ng/mL。7 种噻虫嗪类似物的交叉反应率均不高于 0.3%,特异性较好。分别以黄瓜、青菜和池塘水为对象开展添加回收试验,添加回收率范围为86%108%,相对标准偏差(RSD)为 2.6%9.1%,与超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)分析结果一致。采用该方法对市场购买的黄瓜、青菜和池塘水中的噻虫嗪残留进行检测,
3、最终 3 种样品中噻虫嗪残留均低于检出限。研究结果表明,该 CLEIA 方法灵敏度高,样品前处理简单,环境友好,能够满足黄瓜、青菜和水中的噻虫嗪残留检测。关键词:化学发光酶免疫分析;黄瓜;青菜;水;噻虫嗪;农药残留中图分类号:TQ450.263文献标志码:ADetermination of thiamethoxam residues in cucumber,Brassica chinensis andwater by chemiluminescence enzyme immunoassayGUOZhihui1,2,SONGTianwei1,2,QIANLei1,2,ZHENGKang1,2,C
4、AOHaiqun1,2,3,LIAOMin1,2,3,FANGQingkui*,1,2,3(1.School of Plant Protection,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China;2.Anhui Province Key Laboratory of Integrated PestManagement on Crops,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China;3.Provincial Key Laboratory for Agri-Food Safety,Anhui Ag
5、ricultural University,Hefei 230036,China)Abstract:Inordertoestablishasensitiveandrapiddetectionmethodoftheresiduesofthiamethoxamincucumber,Brassica chinensisandwatersamples,thechemiluminescenceenzymeimmunoassay(CLEIA)ofthiamethoxamresidueswasstudied.ACLEIAmethodwasdevelopedbyoptimizingtheworkingconc
6、entrationofantigenandantibody,thetypeofblocker,methanolcontent,Na+concentration收稿日期:2022-07-05;录用日期:2023-05-07;网络首发日期:2023-07-06.Received:July5,2022;Accepted:May7,2023;Published online:July6,2023.URL:https:/doi.org/10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0053http:/ Journal of Pesticide ScienceE-mail:andpHval
7、ueintheanalyzingsystem.Undertheoptimalconditions,thelinearrangeofthemethodwas0.125-12.5ng/mL,thelimitofquantification(LOQ)was0.125ng/mL,andtheIC50was1.01ng/mL.Thecross-reactionratesofthesevenanaloguesofthiamethoxamwerealllowerthan0.3%,whichindicatedthattheCLEIAmethodhadgoodspecificity.Therecoverystu
8、dyincucumber,Brassicachinensisandpondwatershowedthattherecoveryrangewas86%-108%,andtherelativestandarddeviation(RSD)was2.6%-9.1%,whichwasconsistentwiththeanalysisresultsofultra-highperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry(UPLC-MS/MS).Usingtheestablishedmethod,theresiduesofthiamethoxamin
9、marketsamplesofcucumber,Brassica chinensis andpondwatersampleswasdetected,andtheresultsshowedthattheresiduesofthiamethoxaminthethreekindsofsampleswerelowerthanthedetectionlimit.ThisstudyshowedthattheestablishedCLEIAmethodwashighlysensitive,environmentalfriendly,thesamplepreparationwassimple,anditcan
10、beusedinthedetectionofthiamethoxamresiduesincucumber,Brassica chinensis andwatersamples.Keywords:chemiluminescenceenzymeimmunoassay(CLEIA);cucumber;Brassica chinensis;water;thiamethoxam;pesticideresidues噻虫嗪是一种系统性、接触性的第二代新烟碱类杀虫剂1-2。噻虫嗪作为突触后尼古丁乙酰胆碱受体的激动剂,可以改变昆虫的行为,导致害虫死亡3。通过叶面喷雾及土壤灌根处理,对刺吸式害虫如蚜虫、飞虱、叶蝉
11、、粉虱等有良好的防效4,但与此同时在农产品和环境样品中可能会存在噻虫嗪残留5-7,对人体健康和环境安全带来潜在的威胁8-9。因此,亟需研发一种灵敏、快速的噻虫嗪检测方法,以保障农产品质量安全和环境安全。目前,已有较多的噻虫嗪残留分析方法,如高效液相色谱法10、气相色谱法11-12、高效液相色谱-串联质谱法13-14以及超高效液相色谱-串联质谱法15-16。然而,这些方法需要昂贵的设备、大量的时间、复杂的样品前处理和专业操作人员17-18。已有部分研究者建立了一些以抗体为基础的检测噻虫嗪残留的酶联免疫吸附测定法(ELISA)19-21,但是该方法不能满足人们日益提高的对分析灵敏度的要求。为了应对
12、这些挑战,化学发光酶免疫(chemiluminescenceenzymeimmunoassay,CLEIA)方法应运而生。作为一种免疫分析技术,CLEIA方法除具有酶联免疫分析方法简单、快速的优势外,还可以检测更低的农药残留,灵敏度显著提高,在农药残留分析领域已引起较多的关注22-23。本文的目的是研发一种灵敏、快速、可用于检测部分农产品和环境样品中噻虫嗪残留的CLEIA 分析方法。基于化学发光体系和酶联免疫分析,通过优化抗原和抗体工作浓度,封闭物种类、工作缓冲液中甲醇含量、钠离子浓度及 pH值,建立噻虫嗪 CLEIA 分析方法,并将该方法应用于黄瓜、青菜和水中的噻虫嗪的残留分析。1 材料与方
13、法 1.1 主要试剂及主要溶液配制1.1.1主要试剂和材料农药标准品:噻虫嗪(thiamethoxam,纯度98%),上海源叶公司;啶虫脒(acetamiprid,纯度99%)、噻虫啉(thiaclo-prid,纯度99%)、吡虫啉(imidacloprid,纯度98%)、噻虫胺(clothianidin,纯度95%)、烯啶虫胺(nitenpyram,纯度97%)、氯噻啉(imidaclothiz,纯度98%)和呋虫胺(dinotefuran,纯度97%),德国 Dr.Ehrenstorfer 公司。辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)标记的羊抗小鼠 IgG 抗
14、体,美国 Bosterbio 公司;30%H2O2,中国医药集团有限公司;鲁米诺(luminol),美国Sigma-Aldrich 公司;4-碘苯酚,美国 Acros 公司;明胶(gelatin)、脱脂奶粉,北京索莱宝科技有限公司;鸡卵清蛋白、胰蛋白胨,上海生工生物公司;酵母提取物,美国 OXOID 公司;磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠和氯化钾(均为分析纯),西陇科学公司;乙腈和甲醇(均为 HPLC 级),美国 TEDIA 公司;噻虫嗪包被原和抗噻虫嗪单克隆抗体,本实验室制备24;黄瓜和青菜 Brassicachinensis样品,分别购于合肥市肥西路徽商红府超市和合肥市蜀山区铜锣湾广场菜市场
15、;池塘水样品,取自合肥市蜀山区杏花公园。No.4郭志慧等:化学发光酶免疫分析法检测黄瓜、青菜和水中的噻虫嗪残留9071.1.2主要溶液配制包被缓冲液(CBS):碳酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH9.6);常规液(PBS):磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.4);洗涤液(PBST):含体积分数 0.05%Tween-20 的磷酸盐缓冲液;化学发光增强溶液(现配现用):将鲁米诺溶液(0.01mol/L1.20mL)、H2O2溶液(含体积分数 0.255%H2O2的水溶液267L)、4-碘苯酚溶液(0.05mol/L12L)和 Tris-HCl 缓冲液(0.10mol/L,pH8.5)定
16、容至 12mL。1.2 主要仪器Elx405TM型全自动洗板机,美国 BioTek 公司;DH4000BII 型电热恒温培养箱,天津市泰斯特仪器公司;Nanodrop-1000 紫外分光光度仪,美国 Thermo 公司;SpectraMaxM5 多功能酶标仪,美国 MolecularDevices 公司;各规格单通道移液器、八通道移液器(100L)及高速离心机,德国Dr.Ehrenstorfer 公司;超高效液相色谱-串联质谱仪(ACQUITYUPLC,XevoTQDMS,UPLC-MS/MS),美国 Waters 公司;96 孔白色酶标板 3922,美国 Corning 公司;精密 pH 试
17、纸,英国 Whatman公司;FA2004N 型万分之一天平,上海菁海仪器公司;HOKEE-A1-10 型纯水系统,合肥宏科科技公司。1.3 化学发光读数波长和时间的选择将化学发光增强液加入 96 孔酶标板中,用多功能酶标仪扫描 250700nm 波段,读取化学发光值,确定最适扫描波长;将化学发光增强液加入96 孔酶标板,每隔 2min读取一次发光信号,记录发光信号值,确定最适读数时间。1.4 间接竞争 CLEIA 操作步骤间接竞争 CLEIA(IndirectcompetitiveCLEIA,IC-CLEIA)的操作步骤如下:(1)包被:用包被缓冲液将合适稀释梯度的包被原加入发光板,每孔 5
18、0L,37 孵育 2h;(2)洗板:用洗涤液 PBST 洗涤 5 次,吸水纸拍干;(3)封闭:每孔加入 100L 封闭物,37 孵育 30min;(4)洗板:同(2);(5)加入噻虫嗪和抗噻虫嗪单克隆抗体混合物:每孔加入用工作缓冲液稀释的农药和单克隆抗体各 25L,37 孵育 1h;(6)洗板:同(2);(7)加入酶标二抗:每孔加入 50L 经 1:5000 倍 PBST 稀释的羊抗鼠HRP-IgG,37 孵育 1h;(8)洗板:同(2);(9)加入发光底物:每孔加入 100L 新配制的发光底物液,避光放置 5min;(10)测定:终点法读取425nm 波长下的发光值。1.5 包被原浓度和抗体
19、浓度的优化用碳酸盐缓冲液稀释包被抗原,稀释倍数分别为 1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000 和 1:256000,固定抗体浓度不变,利用梯度浓度的噻虫嗪标准品溶液进行 IC-CLEIA 法分析,筛选合适的包被原浓度。用磷酸盐缓冲液稀释抗噻虫嗪单克隆抗体,稀释倍数分别为 1:24000、1:32000、1:48000、1:64000、1:96000 和 1:128000,固定抗原浓度不变,利用梯度浓度的噻虫嗪标准品溶液进行IC-CLEIA 法分析,筛选合适的抗体浓度。1.6 工作体系的优化1.6.1封闭物质优化选取质量浓度(下同)为5%的脱脂奶粉、2%酵
20、母提取物、1%胰蛋白胨、1%明胶和 1%鸡卵清蛋白 5 种物质作为候选封闭物。首先将封闭物用磷酸盐缓冲液溶解,然后利用梯度浓度的噻虫嗪标准品溶液进行 IC-CLEIA 法分析,研究 5 种封闭物对减少非特异性吸附的影响。1.6.2pH 值优化分别用 pH 值为 6.5、7.0、7.5、8.0 和 8.5 的 PBST 缓冲液稀释抗噻虫嗪单克隆抗体,利用梯度浓度的噻虫嗪标准品溶液进行IC-CLEIA 法分析,建立不同 pH 值下的 CLEIA 分析标准曲线,考察 pH 值对免疫分析体系的影响。1.6.3甲醇含量优化分别用甲醇体积分数为 0%、5%、10%、15%、20%和 25%的 PBST 溶
21、液稀释噻虫嗪标准品,并进行 IC-CLEIA 法分析,建立不同甲醇含量下的 CLEIA 分析标准曲线,考察甲醇含量对免疫分析体系的影响。1.6.4钠离子浓度优化分别用含量为 0、0.05、0.1、0.2、0.4 和 0.8mol/L 钠离子的 PBST 缓冲液稀释抗噻虫嗪单克隆抗体,利用梯度浓度的噻虫嗪标准品溶液进行 IC-CLEIA 法分析,建立不同钠离子浓度下的 CLEIA 分析标准曲线,考察钠离子浓度对免疫分析体系的影响。分析结果判定均以 RLUmax(最大发光值)/IC50(半数抑制浓度)和 IC50值作为评价标准,RLUmax/IC50越高,IC50值越低,灵敏度越高。1.7 噻虫嗪
22、化学发光酶免疫分析标准曲线的建立用最优甲醇含量的 PBST 溶液配制质量浓度分别为 0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、250、500 和1000ng/mL 的噻虫嗪系列梯度标准溶液。在最优908农药学学报Vol.25免疫分析条件下,建立基于抗噻虫嗪单克隆抗体CLEIA 法四参数 Logistic 拟合标准曲线,计算IC50值、定量限(LOQ)25及检测范围。1.8 交叉反应率测定配制噻虫嗪结构类似化合物啶虫脒、噻虫啉、吡虫啉、噻虫胺、烯啶虫胺、氯噻啉和呋虫胺的浓度梯度标准溶液。在最优免疫分析条件下,采用 CLEIA
23、法建立结构类似化合物的标准曲线,计算 IC50值,并按公式(1)计算噻虫嗪结构类似物交叉反应率(CR,%)。CR/%=(IC50T/IC50A)100(1)式中:IC50T为噻虫嗪半数抑制浓度;IC50A为结构类似物半数抑制浓度。1.9 添加回收试验分别以黄瓜、青菜和池塘水为对象研究样品基质对 CLEIA 法检测噻虫嗪残留的影响,供试样品均已利用 UPLC-MS/MS 验证不含有噻虫嗪。将噻虫嗪分别添加到黄瓜、青菜和池塘水样品中进行添加回收试验,以评价建立的噻虫嗪残留 CLEIA方法的可靠性。1.9.1样品制备将黄瓜、青菜切成小块并匀浆。称取 1g 样品于 15mL 离心管中,加入 5mL含体
24、积分数为 5%甲醇的 PBST 作为提取溶剂,用涡旋仪充分振荡提取 2min。将提取液经滤纸过滤后,4000r/min 下离心 5min,取上清液待测;池塘水经滤纸过滤,待测。1.9.2基质效应评价利用最优缓冲液直接稀释基质提取液是免疫分析中降低分析样品基质效应的常用方法。以 5%甲醇的 PBST 为稀释液稀释基质提取液,将黄瓜提取液分别进行 10、20、30、40 倍稀释,将青菜提取液进行 2、5、10、20 倍稀释,将池塘水样进行 1、2、5、10 倍稀释。以不同稀释倍数的基质提取物为溶剂配制不同浓度的噻虫嗪标准溶液,并进行 CLEIA 法测定。以最优缓冲液配制的噻虫嗪标准溶液测定的 CL
25、EIA 结果作为空白对照。1.9.3添加回收率测定和 UPLC-MS/MS 方法验证利用添加标准溶液的方式进行添加回收试验,以噻虫嗪的添加回收率和相对标准偏差(RSD)来评价 CLEIA 法的可靠性。基于基质效应影响,黄瓜匀浆样品中分别添加 100、250、500 和 1000ng/g,青菜匀浆样品中分别添加 125、250、500、1250ng/g,池塘水分别添加 10、25、50 和 100ng/g 的噻虫嗪标准品,混匀后静置 1h,进行样品前处理。将提取液按一定倍数稀释后,用 CLEIA 法测定回收率。为了验证 CLEIA 法检测结果的准确性,黄瓜、青菜和池塘水样品添加标准品后用 UPL
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 化学 发光 免疫 分析 检测 黄瓜 青菜 水中 噻虫嗪 残留
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。