电流刺激对钝齿棒杆菌厌氧条件下代谢通量分布的影响.pdf
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1、144 2023,Vol.44,No.14 食品科学 生物工程电流刺激对钝齿棒杆菌厌氧条件下 代谢通量分布的影响陈小举,张凤琴(巢湖学院生物与环境工程学院,安徽 巢湖 238000)摘 要:研究电流刺激对钝齿棒杆菌厌氧发酵特性的影响,结果显示电流刺激对葡萄糖的代谢及琥珀酸合成具有显著促进作用。当施加5 mA电流时,与0 mA(对照组)相比,葡萄糖消耗速率提升了27.4%,发酵液中琥珀酸质量浓度增加了109.4%,琥珀酸产量增加了62.5%,磷酸戊糖途径(pentosephosphatepathway,HMP)的代谢流量增加了150.6%,胞内NADH/NAD值增加了30.8%。代谢通量计算及关
2、键酶基因表达水平分析结果表明,6-磷酸葡萄糖节点是影响琥珀酸产量的关键节点。电流刺激导致6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因表达水平上调、HMP与琥珀酸合成途径代谢流量增加,是琥珀酸产量升高的主要原因。本研究结果可为发酵工程与电化学学科的进一步交叉融合提供技术参考。关键词:电化学;发酵;钝齿棒杆菌;电流刺激;代谢通量Effect of Electrical Current Stimulation on the Metabolic Flux Distribution of Corynebacterium crenatum under Anaerobic ConditionsCHE
3、N Xiaoju,ZHANG Fengqin(College of Biology and Environmental Engineering,Chaohu University,Chaohu 238000,China)Abstract:Theeffectofelectrical currentstimulationonthefermentationcharacteristicsofCorynebacterium crenatumunderanaerobicconditionswasinvestigated,andthe impacting mechanismwasdiscussedbycal
4、culatingmetabolicfluxesandmeasuringgeneexpression levels.Itturnedoutthatelectrical currentstimulationgreatlycontributedtoglucosemetabolismandsuccinicacidsynthesis.Applyinganelectriccurrentof5mAincreasedtheglucoseconsumptionrate,theconcentrationofsuccinicacidinthefermentationbroth,theyieldofsuccinica
5、cid,themetabolicfluxinthepentosephosphatepathway(HMP),andintracellularNADH/NAD+ratioby27.4%,109.4%,62.5%,150.6%and30.8%respectively,comparedwiththecontrolgroup(0mA).Theresultsofmetabolicfluxandkeyenzymegeneexpressionlevelsindicatedthatglucose-6-phosphatewasthekeynodethatcouldinfluencetheproductionof
6、succinicacid.Electrical currentstimulationup-regulatedtheexpressionlevelsoftheglucose-6-phosphatedehydrogenasegene(zwf)andthephosphoenolpyruvatecarboxylasegene(pepc),andincreasedthemetabolicfluxesintheHMPandsuccinicacidbiosynthesispathway,therebyincreasingtheproductionofsuccinicacid.Theseresultssupp
7、ortthecombinedapplicationofelectrochemistryandfermentation.Keywords:electrochemistry;fermentation;Corynebacterium crenatum;electrical currentstimulation;metabolicfluxDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220816-185中图分类号:Q812 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)14-0144-08引文格式:陈小举,张凤琴.电流刺激对钝齿棒杆菌厌氧条件下代谢通量分布的影响J.食品科学,202
8、3,44(14):144-151.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220816-185.http:/CHEN Xiaoju,ZHANG Fengqin.Effect of electrical current stimulation on the metabolic flux distribution of Corynebacterium crenatum under anaerobic conditionsJ.Food Science,2023,44(14):144-151.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/s
9、pkx1002-6630-20220816-185.http:/收稿日期:2022-08-16基金项目:安徽省自然科学基金项目(1908085QC123);安徽省高等学校自然科学研究重点项目(KJ2021A1019);巢湖学院学科建设质量提升工程项目(kj21kctd03;kj21fdzy02)第一作者简介:陈小举(1984)(ORCID:0000-0002-7708-5212),男,副教授,博士,研究方向为微生物发酵。E-mail:生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.14 145在食品、药品等行业中,琥珀酸与乳酸及其衍生物有着广泛应用。以琥珀酸与乳酸为前体可以合成具有广阔应用前
10、景的可降解生物材料,因此,市场对琥珀酸与乳酸的需求旺盛。利用微生物发酵可再生资源生产琥珀酸与乳酸被认为是减少石化资源消耗和减少碳排放的有效手段,也是最具发展潜力的绿色工艺模式之一1-4。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)是生产精氨酸、谷氨酸等氨基酸的主要菌株之一。钝齿棒杆菌产氨基酸的发酵工艺多是有氧液体深层发酵,且对溶氧水平有较严格的要求5。将钝齿棒杆菌培养环境改为无氧时,琥珀酸与乳酸是其主要代谢产物。研究发现,C4途径是钝齿棒杆菌厌氧合成琥珀酸的主要途径,即由磷酸烯醇式丙酮酸至草酰乙酸,然后经苹果酸与富马酸生成琥珀酸6(图1)。理论上,转化1 mol磷酸烯醇式丙酮
11、酸可以生成1 mol琥珀酸,并需要2 mol还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reducedformofnicotinamide-adeninedinucleotid,NADH)。糖酵解途径(EmbdenMeyerhofpathway,EMP)是钝齿棒杆菌代谢葡萄糖的主要途径,此途径每生成1 mol磷酸烯醇式丙酮酸仅伴随生成1 mol NADH,仅能满足由草酰乙酸至苹果酸或者由富马酸至琥珀酸所需的NADH。因此,厌氧发酵时,钝齿棒杆菌将70%左右的葡萄糖转化为乳酸,而琥珀酸的代谢通量相对较低,不利于联产乳酸与琥珀酸7-8。如果要提高琥珀酸生成比例,利用代谢调控增加琥珀酸生产菌胞内的H还原力水平是可行
12、的方法。比如,ZhengPu等9利用基因组改组技术增加Actinobacillus succiniogenes胞内NADH通量,将琥珀酸产量提高了73%;Zhou Zhihui等10发现表达外源pntAB基因可以明显增加谷氨酸棒杆菌胞内的NADH通量与琥珀酸产量。另一提高琥珀酸产量的有效措施是通过添加电子供体、NAD前体物质调控胞内NADH/NAD值。如姜岷等11通过流加还原剂改变发酵培养基的氧化还原电位水平,实现了对A.succinogenes胞内NADH代谢的调控,将琥珀酸生产效率提高了57.3%11。除以上方法外,电刺激发酵也可用于调控微生物胞内的NADH代谢。电刺激发酵就是将惰性电极插
13、入微生物培养液中,形成一种电解池系统12。当施加电流后,在阴极会产生电子,电子通过传递进入微生物胞内可以提高NADH/NAD值13。电压达到一定值后,阴极还会发生还原反应而产生氢气。产生的氢气可降低胞外氧化还原电位,并作为电子传递供体使胞内NADH/NAD值升高。电刺激发酵技术在发酵产氢、丁醇、丙二醇、琥珀酸等高还原性代谢产物的工艺中得到了初步应用。已有研究发现,低压、低电流刺激可以提高厌氧发酵产氢的能力,其主要原因是微生物胞内NADH可用水平的增加14-15。与琥珀酸相似,NADH不足也是导致丁醇产量较低的主要原因16。HeAiyong等17发现电刺激发酵可以提高Clostridium be
14、ijerinckii IB4胞内的NADH/NAD值,并导致丁醇的产量及生产效率分别增加17.4%与60.3%。ZhouMi等18发现施加电流刺激可以提高甘油对1,3-丙二醇的转化率,代谢流分析结果显示NADH通量增加是1,3-丙二醇产量升高的主要原因。WangZhen等19研究结果表明,对A.succinogenes发酵过程施加电流刺激可以将琥珀酸提高22.4%。?6-?6-?3-?3-?CO2CO2?A?1,6-?1,3-?6-?7-?5-?5-?5-?3-?4-?CO26-?6-?ATPATPNADPNADP?NADP?NAD?NAD?NAD?NAD?NADPHNADPHNADHNADH
15、NADHNADHNADH?CoAADPADPADPADPATPATP?A?图 1 钝齿棒杆菌在厌氧条件下的代谢网络Fig.1 Metabolic network of C.crenatum under anaerobic conditions电化学技术在微生物发酵领域的应用为发酵过程控制及微生物代谢调控提供了新的研究方向13,20,但电刺激对钝齿棒杆菌厌氧发酵特性的影响尚不明确,菌株胞内哪些节点的代谢流分布对电流刺激胁迫产生了应激响应尚不清楚。且目前为止,此方面的研究甚少。因此,本研究以钝齿棒杆菌为发酵菌株,通过改变厌氧发酵过程中的电流强度对胞内NADH代谢进行调控,以提高琥珀酸产量,并对不同
16、电流条件下的代谢通量及基因表达水平进行分析,考察电刺激对钝齿棒杆菌代谢流分布的影146 2023,Vol.44,No.14 食品科学 生物工程响,找出可以联产乳酸与琥珀酸的电流刺激条件。本研究结果将有助于在理论方面掌握电流刺激对钝齿棒杆菌厌氧发酵特性的影响,在应用方面可建立提高琥珀酸生产效率的电刺激发酵工艺,同时对推动发酵工程与电化学学科的交叉融合也具有重要意义。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 菌株钝齿棒杆菌CICC20219,目前由巢湖学院生物工程实验室保藏。1.1.2 培养基培养基A主要用于微生物的快速繁殖,主要成分:葡萄糖40g/L,尿素2g/L,酵母提取物2g/L,酪蛋白氨
17、基酸7g/L,(NH4)2SO47g/L,KH2PO40.5g/L,K2HPO4 0.5g/L,MgSO40.5g/L,FeSO40.006g/L,MnSO4 0.0042g/L,生物素0.0002g/L、硫胺素0.0002g/L21。培养基B主要用于厌氧发酵产乳酸与琥珀酸,主要成分:葡萄糖60g/L,NaHCO316.8g/L,KH2PO40.5g/L,K2HPO40.5g/L,MgSO40.5g/L,FeSO40.006g/L,MnSO4 0.0042g/L,生物素0.0002g/L、硫胺素0.0002g/L21。1.1.3 试剂盒NADH与NAD浓度检测试剂盒(产品序号:A114)、RN
18、A提取试剂盒(产品序号:NO65)、cDNA合成试剂盒(产品序号:N118)南京建成生物工程研究所。1.2 仪器与设备ACQUTIYUPLCH-Classplus超高效液相色谱系统 美国Waters公司;FQD-96A实时荧光定量聚合酶链式反应(real-timepolymerasechainreaction,real-timePCR)仪 杭州博日科技股份有限公司;CHI660E电化学工作站 上海辰华仪器有限公司;ACQUTIYUPLCHSST3色谱柱(100 mm2.1 mm,1.8m)、ACQUTIYUPLCBEHAmideCarbohydrateAnalysisC18色谱柱(100 mm
19、2.1 mm,1.7m)爱尔兰Waters公司;全温摇瓶柜 苏州培英公司。1.3 方法1.3.1 实验设计本研究采用的发酵工艺可分为2 个阶段:有氧阶段与厌氧阶段。有氧阶段主要用于钝齿棒杆菌的快速繁殖,目的是获得大量的菌体;厌氧阶段主要为代谢葡萄糖生产有机酸的发酵阶段。主要过程如下:挑取钝齿棒杆菌接种于含30mL培养基A的250mL摇瓶中,于30、200 r/min培养12 h,按照10%接种量转接于含100mL培养基A的500mL摇瓶中,然后于30、200 r/min培养1012 h。将培养液于5 000 r/min、4 离心10 min,弃上清液并收集菌体,然后将菌体接种于厌氧发酵培养基B
20、,接种量:生物量干质量浓度约为8g/L。厌氧发酵阶段使用100mL的H型电解池为发酵容器(图2)。H型电解池为3电极体系,铂片电极(10 mm10 mm0.1 mm)为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,且置Ag/AgCl电极于阴极电解池,并使用质子膜将阴极与阳极隔开。阳极与阴极电解池均含有80mL培养基B,唯一不同的是:添加3g碱式MgCO3于阴极电解池,用于中和产生的有机酸。电流通过电化学工作站提供,开环条件下的电解池系统为对照组,默认电流大小为0 mA。?H?Ag/AgCl图 2 H型电解池发酵系统示意图Fig.2 Schematic view of H-type electroly
21、tic fermentor1.3.2 分析检测细胞数量通过检测OD600 nm和干质量进行评估。NADH与NAD浓度由辅酶I检测试剂盒测定。利用超高效液相色谱对有机酸和残糖含量进行分析。检测有机酸时,采用二极管阵列检测器,色谱柱为ACQUTIYUPLCHSST3色谱柱(100 mm2.1 mm,1.8m),流动相为0.003 mmol/L硫酸溶液,流速为0.2mL/min,检测波长为210 nm。检测残糖时,采用蒸发光检测器,色谱柱为ACQUTIYUPLCBEHAmideCarbohydrateAnalysisC18色谱柱,流动相为80%乙腈溶液,流速为0.4mL/min。1.3.3 基因表达
22、水平分析钝齿棒杆菌在厌氧条件下培养4 h后,利用TRIzol法提取总RNA,然后反转录得到cDNA,以16S RNA为内参基因,利用real-timePCR仪对6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(zwf)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepc)、苹果酸脱氢酶基因(mdh)及乳酸脱氢酶基因(ldhA)的表达水平进行分析。RNA提取与cDNA合成分别使用相关试剂盒完成。使用的引物如表1所示,引物合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.14 147表 1 real-time PCR使用的特异性引物Table 1 Specific primer seque
23、nces used for real-time PCR引物名称引物序列zwf-FGCCGTGTTACTGAGATTGCCzwf-RTGGAACCGAAGCGGATGAGpepc-FCCACTTCTCGCACGCTCTGTpepc-RTTTGGTCGCCTTTTCGGTAmdh-FGCAACCCAGTTCCCAGACAmdh-RTTAGCCACGCGAGGAATGAldhA-FGCGAACTCTACGAAGTGGCAldhA-RCCTTGGCGTCGATAATGTGA1.3.4 代谢通量分析6-?6-?3-?A?1,6-?1,3-?6-?7-?5-?5-?5-?3-?4-?CO2CO2CO2Co
24、AJ10J9J1J2J3J4J5J6J7J22J23J19J21J20J18J17J16J15J14J13J11J12J27J24J25J26J8NADP?NAD?NAD?NAD?NAD?NAD?NADP?NADPHNADHNADHNADHNADHNADHNADPH?ATPATPATPATPATPADPADPADPADP?PiADP?A?图 3 变量分布示意图Fig.3 Schematic diagram of variables钝齿棒杆菌在厌氧条件下培养时,生物量基本没有变化8,22。因此,本研究不考虑生物量对代谢通量分布的影响。代谢通量计算过程中,假设胞内代谢反应的中间代谢产物处于拟稳态,
25、并能及时转化为下游产物,同时设定NADH与NADPH可无限制相互转换。钝齿棒杆菌在厌氧条件的代谢网络如图1所示,主要由EMP、磷酸戊糖途径(pentosephosphatepathway,HMP)、琥珀酸、乳酸、乙酸等合成途径组成。由图3可知,代谢通量计算时共有27 个变量,围绕6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等代谢中间体可列出代谢通量方程21 个(表2),围绕NADH(NADPH)平衡、三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)平衡可列出代谢通量方程2 个,即共有23 个代谢通量方程,方程自由度为4,因此,需要测定4 个变量才能对代谢通量方程进行求解。本研究取厌氧发酵4 h
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