大蒜遗传转化体系建立与CRISPR-Cas9敲除蒜氨酸酶基因研究.pdf
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1、为了为大蒜转基因研究和蒜氨酸酶基因研究提供技术支撑和理论依据,本文首先建立了愈伤组织再生培养体系,在基因型、生长发育时期、植物激素配比和外植体来源方面对比 MS、B5、N6 和 SH 基础培养基,明确大蒜愈伤诱导和培养的最适基础培养基为 MS 和 SH,其中以苍山大蒜根尖为外植体、培养基为 MS+1 mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA是大蒜愈伤组织诱导的最佳组合;分化阶段为 MS+3 mg/L 6-BA;生根培养和鳞茎诱导阶段则使用不添加任何激素的培养基。然后,通过对影响农杆菌介导遗传转化因素的筛选,得到最佳转化条件:农杆菌菌株选用LBA4404、侵染液组成 MS/LB+100 M
2、 As+1%葡萄糖+1%蔗糖为宜,侵染时间 10 min,共培养 3 d,草铵膦筛选浓度为 250 mg/L,在此条件下该方法的遗传转化率为 1.68%。利用 CRISPR-Cas9 敲除技术,成功实现了对鳞茎蒜氨酸酶关键基因的敲除,突变体中目的基因 mRNA的表达量和蒜氨酸酶活均明显下降。关键词关键词:大蒜;遗传转化;愈伤组织;蒜酶中图法分类号中图法分类号:S633.4文献标识码文献标识码:A文章编号文章编号:1000-2324(2023)03-0319-25Establishment of the Genetic Transformation System and Studieson CR
3、ISPR-Cas9 Knockout Allinase GeneNIU Zhong-lu1,YANG Cai-xia2,LI Ning-yang1,LI Xiang2*1.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China2.State Key Laboratory of Crop Biology,College of Life Sciences,Shandong Agricultural University,Taian 271018,ChinaAbstract
4、:To provide technical support and theoretical basis for garlic transgenic research and allinase gene research.In thispaper,a callus regeneration culture system was established,and MS,B5,N6 and SH were compared in terms of genotype,growth and development stage,plant hormone ratio and the source of ex
5、plants.The optimal medium for callus induction andculture of garlic was MS and SH.The root tip of Cangshan garlic as explants and medium MS+1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA were the best combinations for callus induction.The differentiation stage was MS+3 mg/L 6-BA.In root culture andbulb induction phase,
6、medium without any hormone was used.Then,by screening factors affecting Agrobacterium-mediatedgenetic transformation,the optimal transformation conditions were obtained:The optimal solution was MS/LB+100 M As+1%glucose+1%sucrose with LBA4404 and infecting liquid.The infection time was 10min,the co-c
7、ulture was conductedfor 3 days,and the screening concentration of phosphine oxalammonium was 250 mg/L.Under these conditions,the geneticconversion rate of this method was 1.68%.Using CRISPR-Cas9 knockout technique,the key gene of bulb allinase wassuccessfully knocked out,and the mRNA expression of t
8、arget gene and allinase activity in the mutant were significantlydecreased.Keywords:Allium sativum L.;genetic transformation;callus;allinase大蒜(Allium sativum L.)为百合科葱属植物,原产于伊朗东北部和中亚地区,在全球范围内被用来制作各种菜肴,是我国现存最早记载的可药食两用的作物之一1。众多研究表明大蒜具有多种药理功能,如抗菌、驱虫、抗氧化、抗炎、抗癌等功能,与抗生素相比大蒜还可以增强免疫系统的保护能力2-5。这些药理功能主要是由大蒜素及其
9、代谢化合物发挥作用,大蒜素是蒜氨酸酶催化蒜氨酸的产物6。研究还发现,蒜氨酸酶与大蒜加工过程中的绿变反应有关,它直接参与第一步的绿变反应过程7。通过减弱蒜氨酸酶活性(添加酶抑制剂、加热钝化等方法)探究蒜氨酸酶与绿变的关系,发现大蒜的绿变程度与蒜氨酸酶活性密切相关,对于打破休眠的大蒜蒜氨酸酶活性越高绿变程收稿日期收稿日期:2022-12-24修回日期修回日期:2023-02-22基金项目基金项目:国家自然科学基金面上项目(31972000);山东省重点研发计划项目(2021TZXD001)第第 1 作者简介作者简介:牛忠露(1997-)女,硕士研究生,主要从事食品营养与人类健康研究.E-mail:
10、*通讯作者通讯作者:Author for correspondence.E-mail:320山东农业大学学报(自然科学版)第 54卷度越强8-10。因此,蒜氨酸酶是大蒜中非常重要的一类酶,它在大蒜中具体的功能需要依靠分子生物学的手段去验证,该验证过程是以组织培养和遗传转化体系为基础的。在目前已建立的农杆菌介导的大蒜遗传转化体系中,大部分受体材料选择的是愈伤组织。如以大蒜芽原基、根系、种子和气生鳞茎诱导的愈伤组织为受体建立农杆菌介导的遗传转化体系11-14,但是这些体系普遍存在转化效率低的问题,转化效率在 0.1%1.47%。大蒜愈伤组织遗传转化的效率受多种因素的影响,如愈伤组织的诱导效率、农杆
11、菌菌株、侵染时间、共培养条件等。其中愈伤组织的诱导效率根据基因型、激素配比、培养条件的不同而存在明显的差异。裴雁曦等15以鳞茎盘为外植体,通过计算机模拟推测得出了 2,4-D、NAA 和 6-BA 与愈伤组织诱导率之间的回归方程,愈伤组织最佳诱导培养基为 MS+0.981.14 mg/L 2,4-D+0.931.90 mg/L NAA+1.911.36 mg/L 6-BA。孔素萍16以大蒜鳞茎盘、茎尖、根尖和试管苗叶片为外植体探究在不同激素配比下各外植体的愈伤诱导率,其中愈伤诱导能力较高的是鳞茎盘和根尖,根尖在任何激素配比下的全部诱导出愈伤组织,鳞茎盘最佳诱导培养基为 B5+2 mg/L 2,
12、4-D+0.5 mg/L 6-BA,最高愈伤诱导率也可到100%。唐巧玲等17以根尖为外植体诱导愈伤组织,得出最佳诱导配方为 MS+1 mg/L 2,4-D+0.1mg/L 2ip,愈伤诱导率为 56.06%。为提高农杆菌介导的大蒜遗传转化的效率,本研究首先对影响大蒜愈伤组织诱导及培养的因素进行探究,在该阶段除了使用了前人研究所用的 MS 和 B5 基础培养基,还将 SH 和 N6 基础培养基第一次用于大蒜愈伤诱导并对比它们之间的差异;此外,参考玉米和小麦用胚诱导愈伤的方法,首次选用了鳞茎膨大期不同发育阶段的大蒜进行愈伤组织的诱导18,19。其次,本研究将前人研究所用的遗传转化的条件进行系统的
13、对比,筛选出最佳条件,以期建立更加高效的农杆菌介导的大蒜遗传转化体系。最后,将 CRISPR-Cas9 技术应用于大蒜蒜氨酸酶基因并对转基因植株进行探究,可以为未来大蒜的转基因研究提供技术支撑和理论依据,也为蒜氨酸酶基因的研究和大蒜绿变的研究提供基因资源和参考。1材料材料与方法与方法1.1实验材料实验材料实验所用成熟期大蒜品种包括莱芜大蒜、金乡大蒜、苍山大蒜和邳州大蒜。每年 6 月份分别从当地采收后晾干、置于冷库-2.5 储存。然后选取无明显病斑、无机械损伤的大蒜置于 4 储藏 30d 打破休眠。所用鳞茎膨大期的大蒜品种为金乡大蒜,种植于山东农业大学汶阳现代农业产业园。4 月份大蒜生长发育开始
14、进入鳞茎膨大阶段,从 4 月中旬开始取材,间隔 10 d 取材 1 次,共取 3 次,这 3 次即为初期、中期和后期的材料。去除根须、叶片等的大蒜鳞茎部分作为外植体使用。实验所用的 CRISPR-Cas9 敲除载体为山东农业大学作物学国家重点实验室提供的 SV-Cas9 载体,所用的农杆菌菌株 GV3101、LBA4404、EHA105均采购于上海唯地生物技术有限公司。1.2实验方法实验方法1.2.1 用于大蒜愈伤组织诱导的外植体的获取及消毒处理 大蒜的消毒处理:去除大蒜外层保护叶,用流水冲洗 30 s,接着用 75%乙醇浸泡 15 min,然后在超净工作台内,用无菌水冲洗 3 遍,再用4%次
15、氯酸钠消毒 30 min,取出后用无菌水冲洗 3 遍。鳞芽基部、贮藏叶和茎尖的获取:取已消毒的大蒜鳞茎按图 1 所示的部位取材。鳞芽基部和贮藏叶处理为厚度 0.10.2 cm、再切割成 0.5 cm2大小的组织块接种于培养基上,由于鳞茎膨大初期和中期的大蒜鳞茎较小,接种时只能取鳞芽基部。根尖的获取:取已消毒的大蒜鳞茎,置于 25 的黑暗环境中进行生根培养,时间大约为 1 星期,即可得到无菌苗。然后按图 1 所示的部位取无菌苗的大蒜根尖部位 1 cm 左右进行接种。将外植体接种在愈伤诱导培养基上,以上处理每个培养皿接种 16 块材料,重复 3 次。30 d 后统计各处理组的愈伤诱导率,愈伤诱导率
16、=(出愈外植体数接种外植体数)100%。第 3期牛忠露等:大蒜遗传转化体系建立与 CRISPR-Cas9敲除蒜氨酸酶基因研究321图图 1 外植体取材位置外植体取材位置Fig.1 Location of explants(a)根尖;(b)贮藏叶;(c)茎尖;(d)鳞芽基部。(比例尺:1 cm)(a)Root tip;(b)Storage leaf;(c)Stem tip;(d)The base of garlic clove.(Scale:1 cm)1.2.2 愈伤诱导培养基设计 愈伤诱导培养基的设计包括 MS、B5、N6、SH 四种基础培养基,-萘乙酸(-naphthaleneacetic
17、acid,NAA)和 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)两种生长素,6-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)一种细胞分裂素,并添加了蔗糖(30 g/L)和琼脂(7 g/L),pH=5.8,于高压蒸汽灭菌锅中 121 下灭菌 21 min,倒平板后放置备用。为探究 MS、SH、B5 和 N6 基础培养基对愈伤诱导的影响,实验设置了从不同产地的大蒜(莱芜大蒜、金乡大蒜、苍山大蒜和邳州大蒜)、不同外植体来源(茎尖、鳞芽基部、贮藏叶和根尖)和不同发育时期(鳞茎膨大初期、中期、后期和成熟期)这 3 个方面来进行对比
18、。为探究不同发育期对愈伤诱导的影响,实验选取金乡大蒜的鳞茎膨大期初期、中期、后期和成熟期 4 个时期的鳞芽基部进行愈伤组织诱导。由于鳞茎膨大初期和中期的大蒜鳞茎较小,接种时外植体没有区分部位,后期和成熟期取了鳞芽基部和贮藏叶进行诱导。愈伤诱导培养基具体设计见表1。探究不同外植体部位及不同品种的愈伤诱导差异,愈伤诱导培养基的激素配比详细设计如表 2。根据以上实验结果筛选出愈伤诱导最佳的基础培养基,愈伤诱导能力最强的外植体部位和品种,然后将其接种在表 3 的愈伤诱导培养基上,明确愈伤诱导率最高的 2,4-D 和 6-BA 的配比。表表 1 愈伤诱导培养基种类愈伤诱导培养基种类Table 1 Cal
19、lus induction medium type 基础培养基Basic medium生长素Auxin浓度/mgL-1ConcentrationMS2,4-D2.0NAA2.0B52,4-D2.0NAA2.0N62,4-D2.0NAA2.0SH2,4-D2.0NAA2.0表表 2 愈伤诱导培养基种类愈伤诱导培养基种类Table 2 Callus induction medium type 基础培养基Basic medium2,4-D/mgL-16-BA/mgL-1MS2.00.5B52.00.5N62.00.5SH2.00.5322山东农业大学学报(自然科学版)第 54卷表表 3 2,4-D/
20、6-BA 浓度比值浓度比值Table 3 2,4-D/6-BA concentration ratio2,4-D/mgL-16-BA/mgL-12,4-D/6-BA比值1.00.1101.00.522.00.1102.00.543.00.1303.00.561.2.3 愈伤组织的继代培养 愈伤组织继代培养基和培养条件采取和诱导愈伤组织同样的条件和配方。取诱导的初代愈伤组织,设置愈伤组织的继代周期分别为 30 d,接种于愈伤组织继代培养基上进行培养。培养条件与初代愈伤组织培养条件相同。1.2.4 植物激素的配置 1 mg/ml-萘乙酸(NAA)配制方法:取 30 mg NAA 置于容器中,先加
21、2 mL无水乙醇,充分溶解后再加 28 mL 去离子水。2 mg/mL 2,4-D 配置方法:取 2,4-D 固体 60 mg,先用微量的无水乙醇溶解,溶解后加入 30 mL 水,水浴加热至溶解,常温或 4 保存。1 mg/mL 6-BA配制方法:取 6-BA 30 mg,先用微量 1 mol/L NaOH 溶解,后加入 30 mL 去离子水,常温或 4 保存。1.2.5 培养条件 黑暗环境,温度为 25 1,培养时间 30 d。1.2.6 愈伤组织的分化培养 将胚性愈伤组织接种到分化培养基上进行芽再生培养。愈伤组织诱导芽再生的培养基配方采 MS 培养基,添加激素为 3.0 mg/L 的 6-
22、BA。同时培养基中添加蔗糖(30 g/L)和琼脂(7 g/L),pH=5.8。培养基于高压蒸汽灭菌锅中 121 下灭菌 21 min 后取出放置备用。分化培养共 120 d,每 30 d 继代 1 次,每个培养皿接种 20 5 块愈伤组织,重复 3 次,培养条件为光照培养,光照强度 200 molm-2s-1,光照时间 12 h/d,培养温度为 25 1。待分化培养结束后统计出芽率=分化出芽的愈伤组织块数/接种的总愈伤组织块数100%1.2.7 试管苗诱导形成试管鳞茎 愈伤组织经分化形成不定芽,待其高度达到 35 cm 时,接入另一种固体培养基中(MS,120 g/L 的蔗糖,7 g/L 的琼
23、脂,pH=7.5)诱导生成试管鳞茎,培养条件为光照培养,光照强度 200 molm-2s-1,光照时间 12 h/d,培养温度为 251。培养 6 周左右,试管鳞茎基本成熟,从培养瓶中将其取出,洗去表面培养基,于阴凉处晾干。将收获的试管鳞茎放置在4 下 1 个月,打破休眠,然后栽种在花盆中,待萌发后统计萌发率。萌发率=萌发的试管鳞茎数/栽种的试管鳞茎数100%。1.2.8 试管苗诱导生根及移栽 生根培养基为 MS 基础培养基,添加 30 g/L 的蔗糖、7 g/L 的琼脂,pH=5.86.0,不添加任何激素。将丛生的试管苗分割成单个的试管苗,去除枯叶及死叶,用无菌水冲洗干净基部的培养基,转移至
24、生根培养进行生根培养,培养大约 40 d,注意观察记录生长状况并统计生根率。生根率=接种苗数/生根苗数100%。待生根后的试管苗长至 3 片真叶,生根 34 条时进行移栽。育苗钵的规格为 810 cm,育苗基质为珍珠岩、蛭石、泥炭土(1:3:6)混合均匀制得的。育苗钵中装 2/3 的育苗基质,灭菌;生根的试管苗从育苗瓶中取出,用无菌水把基部和根上的培养基冲洗干净移栽至准备好的育苗钵中,保持培养基质湿润,用保鲜膜将材料封起来,23 d 后逐渐去掉保鲜膜。先放至在弱光条件下,长至有新叶生出时再放置在正常光照条件下培养。最后统计移栽成活率,移栽成活率=移栽苗数/移栽成活苗数100%。1.2.9 CR
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- 大蒜 遗传 转化 体系 建立 CRISPR Cas9 氨酸 基因 研究
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