大肠杆菌感染对小鼠肠道微生物群变化及抗微生物肽表达的影响.pdf
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1、大肠杆菌感染对小鼠肠道微生物群变化及抗微生物肽表达的影响付南燕,孙树婷,周鑫龙,许之靓,邓 琴,彭 偲(宜春学院 医学院,江西 宜春 3 3 6 0 0 0)摘 要:目的:探讨大肠杆菌感染对小鼠肠道微生物群变化及抗微生物肽表达的影响。方法:68周龄S P F级健康雄性C 5 7 B L/6小鼠2 0只,随机分为E.c o l i O1组和对照组,每组1 0只。收集小鼠盲肠内容物,进行1 6 S r R N A测序,采用O T U聚类分析、A l p h a多样性分析、门水平差异分析等方法分别对两组小鼠肠道菌群的多样性、丰度和物种组成进行研究;H E染色观察小鼠空肠、回肠和十二指肠组织病理学变化
2、;采用W e s t e r n b l o t t i n g和R T P C R检测回肠内容物R e g 3 和S 1 0 0 A 8、脂质运载蛋白2蛋白和m R N A表达水平。结果:与对照组比较,E.c o l i O1组O U T、C h a o 1及A C E指数均明显降低(P 0.0 5);在门水平上,E.c o l i O1组的拟杆菌门丰度降低(P 0.0 5),变形菌门的丰度升高(P 0.0 5);E.c o l i O1组回肠内容物R e g 3、S 1 0 0 A 8、脂质运载蛋白2水平较对照组显著升高(P 0.0 5);E.c o l i O1感染导致小鼠肠组织显著病理
3、损伤。结论:大肠杆菌(E.c o l i O1)感染能显著降低盲肠内菌群多样性,刺激小鼠肠道抗微生物肽的表达。关键词:大肠杆菌;肠道微生物;免疫功能;抗微生物肽中图分类号:Q 9 3 9.9 1 文献标识码:A 文章编号:1 6 7 1 3 8 0 X(2 0 2 3)0 6 0 0 7 1 0 5E f f e c t s o f E.c o l i I n f e c t i o n o n C h a n g e s o f I n t e s t i n a l M i c r o b i o t a a n d E x p r e s s i o n o f A n t i m i
4、c r o b i a l P e p t i d e s i n M i c eF U N a n y a n,S U N S h u t i n g,Z HO U X i n l o n g,X U Z h i l i a n g,D E N G Q i n,P E N G S i(C o l l e g e o f M e d i c i n e,Y i c h u n U n i v e r s i t y,Y i c h u n 3 3 6 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a
5、t e t h e e f f e c t s o f E s c h e r i c h i a c o l i i n f e c t i o n o n i n t e s t i n a l m i c r o b i o t a a n d a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e e x p r e s s i o n i n m i c e.M e t h o d s:T w e n t y h e a l t h y S P F m a l e C 5 7 B L/6 m i c e a g e d 6 8 w e e k s w e r
6、e r a n d o m l y d i v i d-e d i n t o E.c o l i O 1 g r o u p a n d c o n t r o l g r o u p,w i t h 1 0 m i c e i n e a c h g r o u p.T h e c e c u m c o n t e n t s o f m i c e w e r e c o l l e c t e d f o r 1 6 S r R N A s e q u e n c i n g.O T U c l u s t e r a n a l y s i s,A l p h a d i v e
7、r s i t y a n a l y s i s a n d g a t e l e v e l d i f f e r e n c e a n a l y s i s w e r e u s e d t o s t u d y t h e d i v e r s i t y,a b u n d a n c e a n d s p e c i e s c o m p o s i t i o n o f i n t e s t i n a l m i c r o f l o r a i n t h e t w o g r o u p s.T h e h i s t o p a t h o l
8、o g i-c a l c h a n g e s o f j e j u n u m,i l e u m a n d d u o d e n u m w e r e o b s e r v e d b y H E s t a i n i n g.W e s t e r n b l o t t i n g a n d R TP C R w e r e u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f R e g 3,S 1 0 0 A 8,l i p i d c a r r i e r p r o t e i n
9、2 p r o t e i n a n d m R N A i n i l e a l c o n t e n t s.R e s u l t s:C o m p a r e d w i t h c o n t r o l g r o u p,t h e O U T,C h a o 1 a n d A C E i n d i c e s o f E.c o l i O1 g r o u p w e r e s i g-n i f i c a n t l y d e c r e a s e d(P 0.0 5).A t t h e p h y l u m l e v e l,t h e a b
10、u n d a n c e o f B a c t e r o i d e t e s i n E.c o l i O1 g r o u p w a s d e-c r e a s e d(P0.0 5),w h i l e t h e a b u n d a n c e o f P r o t e o b a c t e r i a w a s i n c r e a s e d(P0.0 5).T h e l e v e l s o f R e g 3,S 1 0 0 A 8 a n d l i p i d c a r r i e r p r o t e i n 2 o f i l e a
11、 l c o n t e n t s i n E.c o l i O 1 g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d c o m p a r e d w i t h t h o s e i n c o n t r o l g r o u p(P0.0 5).E.c o l i O1 i n f e c t i o n c a u s e d s i g n i f i c a n t p a t h o l o g i c a l d a m a g e t o n o r m a l t i s s u e i
12、n m i c e.C o n c l u s i o n:E.c o l i O1 i n f e c t i o n c a n s i g n i f i c a n t l y r e d u c e t h e d i v e r s i t y o f c e c u m f l o r a a n d s t i m u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f i n t e s t i n a l a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s i n m i c e.K e y w o r d s:E s
13、 c h e r i c h i a c o l i;i n t e s t i n a l m i c r o o r g a n i s m s;i mm u n e f u n c t i o n;a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s17第4 5卷 第6期2 0 2 3年6月 宜春学院学报J o u r n a l o f Y i c h u n U n i v e r s i t y V o l.4 5,N o.6J u n.2 0 2 3 收稿日期:2 0 2 3 0 4 1 7基金项目:江西省卫生健康委科技计划项目(编号:2 0 2 3
14、 1 1 1 8 1)。作者简介:付南燕(1 9 7 6),男,江西高安人,讲师,研究方向为感染及免疫。大肠杆菌(E.c o l i)是世界上传播最广泛的病原体之一,广泛种植在人和动物的器官中,包括胃肠道、呼吸道和皮肤,某些致病性E.c o l i菌株可引起人和动物的细菌性腹泻,如果控制不当,甚至会导致死亡。1致病性E.c o l i O1型是腹泻病最常见的病原菌之一,其特性为可以产生和携带许多特有的毒力因子,包括性菌毛、细胞表面亚基、肠毒素、内毒素、黏附素、定居因子、细胞毒性坏死因子、铁相关蛋白等,大多是血清型和种系群。23众所周知,胃肠道微生物群与宿主免疫系统保持复杂的相互关系,肠道菌群在
15、肠道细菌和病毒感染中也起着重要作用。45既往研究大多集中于抗生素诱导肠道菌群变化,而E.c o l i O1感染情况下肠道菌群及宿主免疫状态如何,目前尚未见相关报道。为此,本研究探讨大肠杆菌感染对小鼠肠道微生物群变化及抗微生物肽表达的影响,以期为临床采用微生态调节方法治疗或预防肠道细菌感染提供实验依据。1 材料与方法1.1 实验动物5周龄S P F级健康雄性C 5 7 B L/6小鼠,源自杭州子源实验动物科技有限公司。体重(2 02)g。所有小鼠均饲以充足的S P F级饲料,温度稳定在(2 2 1),湿度保持在(5 55)%,1 2/1 2 h黑暗光照循环,持续1周。61.2 大肠杆菌E.c
16、o l i O1制备大肠杆菌E.c o l i O1在L u r i a B E R T A N I(L B)培养基中于3 7 培养2 4小时,直到在6 3 0 n m处的吸光度达到0.0 8 0.1(O D 6 3 0=0.1),7最终细胞密度估计为2.5 0 1 01 1 C F U/m L。1.3 实验分组将2 0只小鼠随机分为两组,每组1 0只。E.c o l i O1组:参考孔春梅等8的研究,腹腔注射致病性E.c o l i O1悬液(2.5 0 1 01 1 C F U/m L),0.2 m L/只,构建小鼠腹泻模型6;对照组:腹腔注射等量无菌生理盐水,0.2 m L/只。两组实验
17、均需要观察并记录3 d内小鼠的饮食、外观、行为、精神、排泄等表型变化。各组小鼠饲养3天后脱臼处死,收集空肠、回肠、十二指肠组织,用于组织病理学观察,一部分回肠组织迅速放入8 0 冰箱保存,备基因和蛋白检测。收集盲肠内容物,并立即在液氮中冷冻,备基因测序。1.4 H E染色根据之前的文献9取小鼠空肠、回肠和十二指肠组织置4%中性甲醛固定液中固定,组织修块。组织块经梯度酒精脱水后石蜡包埋,切片厚度为5 m,经下行酒精梯度入水后行H E染色,光学显微镜下观察。1.5 D N A提取、P C R扩增、定量和1 6 S r R N A基因测序按照制造商的说明,使用杭州富纳诺纳米技术有限公司提供的商业磁珠
18、用D N A分离试剂盒,从冻干小鼠盲肠内容物中提取微生物基因组D N A(g D N A)。然后用通用引物(上游引物:5 A C T C C T A C G G G A GG C A G C A G 3;下游引物:5 G G A C T A C H V G G G TWT C T A A T3)扩增从盲肠内容物中提取的g D N A。按照靶向细菌1 6 S r R N A基因的V 3 V 4区,使用以下循环条件:5 0 2分钟,9 5 1 0分钟,9 5 1 5 s,5 6 3 0 s,7 2 1分钟,重复4 0个循环。通过在I l-l u m i n a M i S e q 3 0 0平台上
19、进行双索引扩增和测序,然后进行Q I I M E(1.9.1)生物信息学分析,确定每组5只小鼠的肠道微生物组的组成。再分析出样品中的多样性(包括C h a o 1/A C E,S i m p s o n/S h a n n o n指数和C o v e r a g e指数)和微生物群落结构,利用M o t h u r软件对每组样品的操作分类单元(O T U)进行聚类分析。1.6 R TP C R检测回肠组织R e g 3 和S 1 0 0 A 8、l i-p o c a l i n 2 m R N A表达水平取新鲜冰冻回肠组织,匀浆处理,使用T R I z o l(T h e r m o F i
20、 s h e r S c i e n t i f i c)提取总R N A。采用高容量c D N A逆转录酶试剂盒(T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c)合成c D N A。按照说明书进行检测,引物序列见表1。以a c t i n为内参,以2 C T表示。表1 R T q P C R引物序列引引物物引引物物序序列列引引物物大大小小a c t i n正向5 A G C G A G C A T C C C C C A A A G T T 3 反向5 G G G C A C G A A G G C T C A T C A T T 3 2 8 5 b
21、pR e g 3 正向5 A T T G C G A G G C A T A T G G A A G T T G C C A A G A A A G A T G C C C C A T3 反向5 C T A T G G G G A T C C C T A G G C C T T G A A T T T G C A G3 S 1 0 0 A 8正向5 A C A G G G A T G A C T T C A G G A A A A T G3 反向5 C C A C C C T T A T C A C C A A C A C A A G3 l i p o c a l i n 2正向5 A G A
22、 C C T A G T A G C T G T GG A A A C C A T G 3 反向5 G C C T T C T G T T T T T T T C T G G A C C G C 3 27第6期 宜春学院学报 第4 5卷1.7 W e s t e r n b l o t t i n g检测回肠组织R e g 3 和S 1 0 0 A 8、l i p o c a l i n 2蛋白表达水平取冻存的回肠组织,匀浆处理,采用R I P A裂解缓冲液提取回肠组织中蛋白,B C A法蛋白定量。按照常规操作进行蛋白检测。蛋白条带在化学发光试剂(E C L)下显影,以a c t i n为内参
23、照,结果采用凝胶图像分析软件B a n d S c a n进行分析。1.8 统计学分析采用G r a p h p a d p r i s m 5.0软件进行统计学处理,计量资料采用以均值标准差(x s)表示,两组间比较采用t检验,P 0.0 5为差异有统计学意义。2 结果2.1 致病性E.c o l i O1悬液腹腔注射与C o n组小鼠比较,E.c o l i O1组小鼠在给菌3 h后表型出现显著变化,出现腹泻、行动迟缓、食欲差、毛发蓬松等症状,而C o n组小鼠表型均无明显变化。2.2 小鼠盲肠菌群多样性使用具有9 7%相似性阈值进行O U T s划分,结果如表2所示,E.c o l i
24、O1组的O U T、C h a o 1、A C E指数显著低于对照组(P 0.0 5),两组盲肠内容物菌群的C o v e r a g e指数均在9.7以上,因此,样品测序质量较高。表2 肠道菌群多样性分析结果比较OO UU TT ssCC hh aa oo 11AA CC EESS hh aa nn nn oo nnSS ii mm pp ss oo nnCC oo vv ee rr aa gg eeC o n1 0 8 7.8 6 6 3.9 01 1 8 5.7 1 7 2.9 81 2 1 9.8 6 8 8.9 97.3 8 0.0 80.9 5 0.0 3 0.9 9 6 0.0
25、0 4E.c o l i O19 5 8.2 9 8 8.4 51 0 4 6.4 3 1 3 9.6 6 1 0 8 9.8 6 1 2 6.2 86.8 8 1.0 60.9 7 0.0 1 0.9 9 7 0.0 0 6t3.1 4 22.3 3 92.2 2 61.2 4 11.7 2 12.6 3 8P0.0 0 8 50.0 3 7 50.0 4 5 90.2 3 8 30.1 1 0 10.0 2 1 62.3 小鼠盲肠菌群构成盲肠内容物样本中前6个菌群(拟杆菌门B a c t e-r o i d e t e s、厚壁菌门F i r m i c u t e s、变形菌门P r o
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