一株宽裂解谱鼠疫噬菌体的生物特性和基因组研究_靳海晓.pdf
《一株宽裂解谱鼠疫噬菌体的生物特性和基因组研究_靳海晓.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一株宽裂解谱鼠疫噬菌体的生物特性和基因组研究_靳海晓.pdf(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、*实验研究*一株宽裂解谱鼠疫噬菌体的生物特性和基因组研究靳海晓1,3,钟佑宏2,郭瑾3,张传宇3,李论2,申小娜3,段存娟2,黄英3,熊浩明1,王鹏2,李伟1,3摘要:目的鉴定一株分离自既往鼠疫疫源地的褐家鼠盲肠的鼠疫噬菌体 vB_YpeM_ESS14(ESS14)的生物学特性、电镜形态及其基因组特征。方法以鼠疫疫苗株 EV76 为宿主菌,通过测定噬菌体 ESS14 的裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线、热稳定性、PH 稳定性和紫外线稳定性以及透射电子显微镜形态观察了解 ESS14 的生物学特性,通过基因组测序分析阐述其基因组特征。结果ESS14 能裂解多种大肠埃希菌和志贺菌,此外 ESS14
2、 还能裂解鼠伤寒沙门菌和布利丹沙门菌;ESS14 的最佳感染复数为0.01,爆发潜伏期 10min,爆发量为 120PFU/ml;ESS14 在温度 2860和 pH(310)条件下效价稳定;ESS14 基因组由 170013bp的双链 DNA 组成,G+C 含量为 40.50%,包含 295 个开放阅读框(ORFs),其中有 2 个为 tRNA(tRNA-Arg-TCT 和 tRNA-Met-CAT)。结论基因组特定鉴定分析表明 ESS14 属于 CaudoviralesStraboviridaeTevenvirinaeGapriverviru;ESS14 具有较宽的裂解谱,潜伏期短,爆发量
3、高,对温度、pH、紫外线稳定性良好,未来用其作微生态制剂减灭鼠疫疫源地中的鼠疫菌方面具有潜在的应用价值。关键词:鼠疫菌;噬菌体;生物特性;基因组特征中图分类号:R211;R516.8;R378文献标志码:A文章编号:10039961(2023)05052207Biologicalandgenomiccharacteristicsofabroad-spectrumYersiniapestisbacteriophageJin Haixiao1,3,ZhongYouhong2,Guo Jin3,Zhang Chuanyu3,Li Lun2,Shen Xiaona3,Duan Cunjuan2,Hua
4、ng Ying3,Xiong Haoming1,Wang Peng2,Li Wei1,3.1.Department of Public Health of Medical Department of Qinghai University,Xining 810016,Qinghai,China;2.YunnanInstitute for Endemic Disease Control and Prevention,Dali 671000,Yunnan,China;3.National Institute for CommunicableDisease control and Prevention
5、,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,ChinaCorresponding authorsCorresponding authors:Xiong Haoming,Email:;Wang Peng,Email:;Li Wei,Email:Abstract:ObjectiveTodeterminedthemorphological,biologicalandgenomiccharacteristicsofvB_YpeM_ESS14(ESS14),aYersinia pestisbacteriophagei
6、solatedfromasilentplaguefocusinYunnan.MethodsUsingY.pestisvaccinestrainEV76ashostbacteria,themorphological,biologicalandgenomiccharacteristicsofESS14weredeterminedbytransmissionelectronmicroscope,growthandthermo,pHstabilitytests,aswellashostrangeanalysis.ResultsESS14couldlysesomespeciesofEscherichia
7、 coliandShigella,inadditionESS14canlyseSalmonella typhimuriumandSalmonella blidan.TheOptimalMultiplicityofInfection(MOI)ofESS14was0.01,thelatentperiodwasshorter,andtheburstsizewasabout120PFU/cell.ESS14hascomparativelystabilityattemperaturesrange(2860)andpHsrange(310).TheESS14genomeconsistsof170013bp
8、doublestrandedDNA,withaG+Ccontentof40.50%,andcontains295codingsequences(CDS),twoofwhicharetRNAs(tRNA-Arg-TCTandtRNA-Met-CAT).ConclusionGenomicanalysisrevealedthatESS14belongedtoCaudoviralesStraboviridaeTevenvirinaeGaprivervirus.Becausethisphagehasthecharacteristicsofbroad-lysisspectrum,shortlatentpe
9、riod,highburstsize,aswellastheabilitywithstabilitytotemperature,pHandUV,suchcharacteristicsindicatedthatESS14hastheapplicationvalueonreducingY.pestisinplaguefocusinthefuture.Keywords:Yersinia pestis;Bacteriophage;Biologicalcharacteristics;GenomiccharacteristicsThestudywassupportedbytheBiosafetyKeyRe
10、searchandDevelopmentProject(No.2021YFC1200204),InnerMongoliaMajorScienceandTechnologyProject(No.2021ZD0006),NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.32260039),andYunnanLeadingTalentsProgram(No.L-2019001)基金项目:生物安全重点研发项目(No.2021YFC1200204);内蒙古科技重大专项(No.2021ZD0006);国家自然科学基金(No.32260039);云南领军人才项目(No.L
11、-2019001)作者单位:1.青海大学医学部公共卫生系,青海西宁810016;2.云南省地方病防治所,云南大理671000;3.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京102206作者简介:靳海晓,女,青海省海东市人,硕士研究生,主要从事鼠疫防治工作,Email:通信作者:熊浩明,Tel:010-58900770,Email:;王鹏,Tel:010-58900770,Email:;李伟,Tel:010-58900770,Email:收稿日期:20221213网络出版日期:20230518522疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,20
12、23,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202212130534鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)感染引起的一种人畜共患病,其宿主主要是啮齿动物,跳蚤被认为是主要的传播媒介1。鼠疫曾在世界范围内发生过三次大流行,共造成了约 2 亿人死亡2。最近一次较大规模肺鼠疫暴发发生在 2017 年的马达加斯加3。噬菌体因能高效且特异地杀死宿主菌而用在耐药菌株感染控制及农业和畜牧业的环境灭菌等方面,这些应用已经成为近年研究的重点。早在 1925 年dHerelle4从鼠身上分离出一种高毒力的鼠疫噬菌体并尝试治疗 4 例腺鼠疫患者获得成功。Vagima等5通过体外模拟
13、实验表明鼠疫噬菌体治疗不仅能够延缓死亡,提高存活率,而且与抗生素联合用药能产生适应性免疫力。由于不断地从鼠疫患者或啮齿动物中分离到耐多种抗生素和/或链霉素的鼠疫菌69,因此利用鼠疫噬菌体开展鼠疫治疗应该也可以成为一种替代的抗菌疗法。近年来,国内外研究者从组织样本、排泄物及自然环境分离到了许多鼠疫噬菌体1013。目前文献中描述的鼠疫噬菌体约 40 余株,已经测序的鼠疫噬菌体共 21 株,包括 9 株短尾噬菌体(Podoviridae)1314,10 株肌尾噬菌体(Myoviridae)1012,15,1 株长尾噬菌体(Siphoviridae):PY100 和 1 株 丝 状 噬 菌 体(Ino
14、virus):Ypf-ph16。本试验以鼠疫菌疫苗株EV76 为宿主菌,对自云南既往鼠疫疫源地(玉溪市峨山县)褐家鼠盲肠分离的一株噬菌体 ESS14 进行了生物学特性测定和基因组分析,以期将来作为一种微生态手段用于消减鼠疫疫源地疫源性。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株本研究分离噬菌体所用的鼠疫疫苗株EV76、用于鼠疫噬菌体裂解谱实验的 114 株菌株均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所鼠疫室保存,具体包括 33 株耶尔森菌、17 株大肠埃希菌、14 株志贺菌、13 株沙门菌、13 株肠杆菌、8 株克罗诺杆菌、4 株克雷伯菌、2 株肠球菌,李斯特菌、变形杆菌、不动杆菌、嗜血杆菌、莫拉菌、
15、巴斯德菌、柠檬酸杆菌、摩根氏菌、普罗威登斯菌和沙雷菌各 1 株。1.1.2主要试剂及仪器普通营养琼脂(NA)、LB 肉汤和琼脂粉、0.22m 滤器、磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline,PBS)等均购自北京颐圣兆博生物科技有限公司;仪器:Sigma 离心机(Sigma3-16PK,德国)、Sigma 离心机(Sigma3K30,德国)、eppendorf 离心机(Centrifuge5424,德国)、透射电子显微镜(HitachiHT7700,日本)、低温摇床(IKAKS3000i,中国)。1.2方法1.2.1菌株培养鼠疫菌减毒疫苗株(EV76)作为宿主菌用于噬菌体的分
16、离和增殖。用于增殖噬菌体的 EV76 在 LB 培养基,28、180rmp 培养过夜(1824h);用于分析宿主范围的 114 株菌在LB 固体培养基,37培养过夜。1.2.2噬菌体分离纯化采用点滴法分离噬菌体17。分离方法如下所述,采集的样品用 PBS 缓冲液浸泡过夜,各取 2mL 浸泡液和 1mL 对数生长期EV76 菌液(培养 1824h)置于 10mL 的 LB 液体培养基中28、180r/min培养过夜。将噬菌体增殖液以4472g 离心 5min,用 0.22m 过滤器过滤上清液,滤液用于噬菌体检测。取对数期EV76菌液200L加入到 50 的 0.5%LB 半固体培养基,迅速倾倒于
17、固体培养基平板上,待半固体凝固后取 10L 上述过滤液滴于平板上,正置于 28 培养箱培养过夜,观察有无噬菌斑。进一步鉴定之前,噬菌体采用双层平板法单斑纯化 35 次17。对噬菌体完成三次单斑分离后,使用聚乙二醇(PEG8000)沉淀法纯化噬菌体,即在 4 下以 4472g 离心噬菌体纯培养液 5min,并通过 0.22m 滤膜过滤上清液,将噬菌体颗粒从混合培养物中分离。然后向滤液中添加DNaseI和RNaseA至终浓度为1g/mL,并在37、220rpm 培养 30min。随后,向噬菌体悬浮液中添加氯化钠至终浓度为 5.48g/100mL,振荡溶解,在冰浴中沉淀噬菌体 1h。4、6010g
18、离心 10min后吸出上清液,在上清液中加入 PEG8000 至终浓度 10%(w/v),振荡溶解,并在冰浴中沉淀噬菌体 1h。然后在 4、6010g 离心 30min,弃上清液并倒置 35min 干燥,最后用 PBS 缓冲液溶解沉淀物。1.2.3噬菌体形态观察将噬菌体纯培养液在 4、4472g 下离心 3min,吸取上清,重复上述步骤,共离心 3 次。碳涂层铜网格膜面蘸取噬菌体制剂10min,用滤纸吸去多余液体,然后铜片蘸少许蒸馏水去除 PBS。最后,用 1%醋酸铀对碳涂层铜网格染色 1min,使用透射电子显微镜(HitachiHT7700,80kV)观察噬菌体形态。1.2.4噬菌体裂解谱测
19、定本研究共选择了 114 株肠杆菌科菌作为受试菌株(表 1),采用点滴法测定噬菌体 ESS14 的宿主谱。以营养琼脂培养基做底层平板,取生长至对数期的受试菌株 200L 加入到融化并 50 保温的半固体 LB 培养基中,迅速倾倒于底层平板并晃动平板,使半固体均匀铺于底疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5523www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202212130534层平板表面。每个菌株制备 2 块双层平板。待上层半固体培养基凝固后,取 10L 的噬菌体纯培养液滴定在平板上,正置于生
20、化培养箱中,分别于 28和 37 培养过夜(1824h),观察有无噬菌斑。1.2.5噬菌体最佳感染复数(multiplicityofinfection,MOI)测定按照 MOI 分别为 100、10、1.0、0.1、0.01、0.001 的比例加入噬菌体 ESS14 的纯培养液和对数生长期的 EV76。在 37、180r/min培养2h 后,取 200L 噬菌体液 9397g 离心 2min,然后,用 PBS 缓冲液倍比稀释以点滴法测定噬菌体效价。之后,每隔 1h 测量一次噬菌体效价,直至培养 9h。1.2.6一步生长曲线噬菌体 ESS14 的纯培养液和对数生长期 EV76(106CFU/mL
21、)菌液按照最佳感染复数的比例加入到 LB 液体培养基中,在 37 下吸附 10min,然后以 6010g 离心 3min,去除未吸附的噬菌体。将沉淀重新悬浮在 1mLLB 液体培养基中并在 37、180r/min培养 2h,于 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 和 100min 取 100L 噬菌体液,9397g 离心 2min,取上清液用 PBS 缓冲液连续稀释 10 倍后采用点滴法测定效价。1.2.7噬菌体热稳定性测定取噬菌体纯培养液(1.7108PFU/mL)在 28、37、50、60、70 和 80 孵育 1h,于 0、15、30、45、60min 各取 100
22、L 噬菌体液,用 PBS 缓冲液连续 10 倍稀释后采用点滴法测定效价。1.2.8噬菌体pH 敏感性测定用1mmol/L 的NaOH或HCl 调节PBS 缓冲液至pH 为1.011.0,将100L噬菌体纯培养液(2.1109PFU/mL)加入 900L 不同 pH 的 LB 液中,在室温下孵育噬菌体 90min,每个样品取 100L 用 PBS 缓冲液连续稀释 10 倍,用点滴法测定效价。1.2.9噬菌体紫外线敏感性测定取 2mL 噬菌体纯培养液(1.7109PFU/mL)置于直径 54mm 的平表 1受试菌株列表Table1Listoftestedstrains受试菌株受试菌株受试菌株L56
23、-假结核菌Sa10162-阿贡纳沙门菌JLSAL0003-布利丹沙门菌L51-假结核菌LT2-鼠伤寒沙门氏菌ATCC19003-鲍曼不动杆菌L61-假结核菌Sa5173-肯塔基沙门氏菌A398-小肠结肠炎耶尔森菌L46-假结核菌Sa4370-肠炎沙门氏菌ATCC11296-肺炎克雷伯菌DY29-假结核菌Sa3101-德尔比沙门氏菌ATCC43863-催产克雷伯菌DY39-假结核菌51197-痢疾志贺氏菌NMVRE0001-耐药肠球菌DY55-假结核菌51361-福氏志贺菌ATCC49766-流感嗜血杆菌DY95-假结核菌51081-鲍氏志贺氏菌ATCC25240-卡他莫拉菌071q42-假结核
24、菌51571-Fla-宋内氏志贺菌ATCC27883-产气巴斯德氏菌071q74-假结核菌14190-鲁氏耶尔森菌CMCC(B)43201-大肠埃希氏菌YW22-假结核菌301SL001-福氏志贺菌CMCC(B)44102-大肠埃希氏菌tt78-2假结核菌JLSH0001-鲍氏志贺菌FC7792-大肠埃希氏菌53504-假结核菌JLSH0002-宋内志贺菌FC11505-鼠伤寒沙门氏菌52301-小肠结肠炎耶尔森菌HBSH0001-福氏志贺菌CMCC(B)47576-鼠伤寒沙门氏菌Y61-1-小肠结肠炎耶尔森菌HBSH0002-鲍氏志贺菌CMCC(B)50976-鼠伤寒沙门氏菌YL201409
25、17255-小肠结肠炎耶尔森菌HBSH0003-痢疾志贺菌CMCC(B)45108-产气肠杆菌52202-小肠结肠炎耶尔森菌HBSH0006-宋内志贺菌FC14153-产气肠杆菌52204-小肠结肠炎耶尔森菌ATCC25922-大肠埃希菌CMCC(B)45107-产气肠杆菌342-费氏耶尔森菌HBEC0001-侵袭性大肠埃希菌ATCC13883-肺炎克雷伯菌877-费氏耶尔森菌ZJLM0001-单增李斯特ATCC29212-粪肠球菌Y.K-克氏耶尔森菌ATCC29544-阪崎克罗诺0912-鲍氏志贺菌52207-小肠结肠炎耶尔森菌ATCC51329-穆汀斯克罗诺A3-猪霍乱沙门菌52225-小
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 一株宽 裂解 鼠疫 噬菌体 生物 特性 基因组 研究 靳海晓
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。