一株虾源假交替单胞菌(Ps...口服后对对虾体内弧菌的影响_朱娜.pdf
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1、第 38 卷第 2 期大连海洋大学学报Vol38 No22 0 2 3 年 4 月JOUNAL OF DALIAN OCEAN UNIVESITYApr 2 0 2 3DOI:1016535/jcnkidlhyxb2022-150文章编号:2095-1388(2023)02-0223-10一株虾源假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)的分离鉴定及口服后对对虾体内弧菌的影响朱娜1,2,王秀华2*,张红芳2,李婷3,王平3,张雪梅2(1.浙江海洋大学 水产学院,浙江 舟山 316022;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海水养殖病害防治重点实验室,青岛市海水养殖流
2、行病学与生物安保重点实验室,山东 青岛 266071;3.海南中正水产科技有限公司,海南 东方572632)摘要:为探讨对虾细菌性病原的微生物防控技术,采用牛津杯打孔法对分离自对虾育苗池的一株编号为2021041402-14 的细菌(简称“02HN”)进行了抗菌测试,分析其对欧文氏弧菌(Vibrio owensii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、坎贝氏弧菌(V.campbellii)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)等 6 株虾病原菌的抑菌效果及最低抑菌浓度,通
3、过浸泡感染测试了菌株 02HN 对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的生物毒性,采用 16S rNA、gyrB-rpoD 串联基因序列比对法及生理生化方法对该菌进行了鉴定,并将该菌添加到饲料中投喂对虾,评价该菌对对虾体内弧菌数量的影响。结果表明:菌株 02HN 对欧文氏弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和美人鱼发光杆菌均具有抑菌效果,其最低抑菌浓度分别为 2.32104、2.32103、2.32106、2.32106、2.32103、2.32106CFU/mL;采用 02HN 浓度为 1107CFU/mL 以下的菌液浸泡凡纳滨对虾,生物毒性不明显;分子鉴定显
4、示,该菌与杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)及金丽假交替单胞菌(P.flavipulchra)最为接近,为一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.);对虾摄食菌含量分别为 1105、1107cells/g 的饵料后,其存活及生长无显著性变化,但能显著降低对虾肝胰腺中的弧菌数量(P0.05)。研究表明,菌株 02HN 在对虾养殖中具有开发应用潜能,本研究结果可为对虾细菌性病原的生物防控提供生物材料及技术思路。关键词:凡纳滨对虾;假交替单胞菌;拮抗菌;对虾病原菌中图分类号:S 945.1文献标志码:A中国养殖对虾年产量已经突破 200 万
5、 t1,对虾养殖业已成为渔业经济的重要支柱。然而在对虾养殖业快速发展的同时,对虾疾病也成为影响产业发展的关键问题,特别是近年来新出现的由病原菌感染导致的对虾急性肝胰腺坏死病、玻璃苗症等,给中国的对虾养殖业带来了严重危害2-3。目前,已确定的对虾病原有副溶血弧菌(Vibrio parahaemo-lyticus)4、哈维氏弧菌(V.harveyi)5、坎贝氏弧菌(V.campbellii)6、欧文氏弧菌(V.owensii)7、溶藻弧菌(V.alginolyticus)8 和美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)9 等。水产养殖中对细菌病的防控方法,传统上多采用抗生素进
6、行处理10,而抗生素的使用可对环境及人类健康产生较多的潜在危害11。近年来,为满足市场对绿色健康水产品的需求,水产动物疾病的生物防控技术受到了广泛重视,其中,益生菌已广泛用于水产养殖中的多个环节12,并在改善水质、提高养殖动物免疫力、促进鱼虾肠道健康等方面发挥了不同的作用。研究发现,在海洋环境中有些假交替单胞菌属的细菌能够分泌抑菌物质13-14,并表现出极大的潜在开发前景。本研究中,从海南一个对虾育苗场的虾苗池水中,分离到一株对对虾多种病原菌具有明显抑制作用的海洋细菌,并对该菌的分类地位进行了初步的收稿日期:2022-05-10基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”项目(2019YFD
7、0900105);“科技助力经济 2020”重点专项(SQ2020YFF0425682);中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费(20603022018001)作者简介:朱娜(1996),女,硕士研究生。E-mail:1364988922 通信作者:王秀华(1969),男,研究员。E-mail:wangxh 研究,开展了该菌对多种病原菌的拮抗效果评价,分析了该菌株的生物安全性及应用效果,以期为解决对虾细菌病危害严重的问题提供技术参考。1材料与方法1.1材料菌株安全性评价所用凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)购于山东潍坊某对虾养殖场,体长为(7.400.49)cm,体质
8、量为(4.260.21)g。养殖用凡纳滨对虾来源于海南某育苗场,体长为(3.140.33)cm,体质量为(0.260.02)g。弧菌拮抗用指示菌分别为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、欧文氏弧菌、溶藻弧菌和美人鱼发光杆菌;攻毒感染试验中,对照组细菌用副溶血弧菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);溶血对照组细菌及生理生化鉴定用参考菌株为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida 2515)15(以下简称“2515”)。上述菌株均来自农业农村部海水养殖病害防治重点实验室。羊血平板购自北京陆桥技术股份有限公司,鱼血平板制备参考张宇哲等15 的方法。1
9、.2方法1.2.1菌株采集与分离纯化从海南省某对虾育苗场虾苗池中采集水样,置于 1.5 mL 无菌离心管,低温保存带回实验室。在无菌条件下,取水样于2216E 平板上划线分离纯化,共分离出 15 株海洋细菌,通过平板点种法筛选出一株对哈维氏弧菌、副溶血弧菌和欧文氏弧菌均具有拮抗作用的菌株,编号为 2021041402-14(简称“菌株 02HN”),将纯培养后的菌株 02HN 保存备用。1.2.2拮抗菌的筛选将副溶血弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、欧文氏弧菌、溶藻弧菌和美人鱼发光杆菌分别接种于 2216E 液体培养基,在 28 下以 150 r/min 恒温摇床振荡培养 24 h,用无菌PBS
10、稀释成浓度为 1107CFU/mL 的菌悬液,取100 L 菌悬液均匀涂布于 2216E 固体平板。用接种环挑取少量活化 24 h 的待筛选菌株,点种于上述平板上,并对各测试菌株进行编号,于 28 恒温培养箱中培养 24 h 后,观察点样区是否有透明抑菌圈,每个样品设 3 个平行。1.2.3拮抗菌抑菌效果的测定参考李静舒等16 的方法,采用牛津杯打孔法进行拮抗菌抑菌效果的测定。分别取浓度为 1107CFU/mL 的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、欧文氏弧菌、溶藻弧菌和美人鱼发光杆菌的发酵液 100 L,均匀涂布于 2216E 固体培养基上,用牛津杯在平板上等距打 4 个孔,其中,2 个孔内
11、放置 50 L 拮抗菌发酵液(浓度为 1 108CFU/mL),另 2 个孔放置50 L无菌 PBS 作为空白对照,每个平板设 3 个重复,待菌液被完全吸收后,倒置于 28 恒温培养箱中培养 24 h。采用游标卡尺十字交叉法测量抑菌圈直径,结果取 3 个平行的平均值。1.2.4最低抑菌浓度的测定将浓度为 2.32108CFU/mL的拮抗菌发酵液,用无菌 PBS 进行10 倍梯度稀释,最低稀释到 2.32102CFU/mL,参照“1.2.3 节”的方法,以浓度为 1107CFU/mL的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、欧文氏弧菌、溶藻弧菌和美人鱼发光杆菌为指示菌,进行各稀释梯度发酵液的抑菌试验
12、,每个平板打 4 个孔,用无菌 PBS 作为空白对照,每个平板设 3 个平行,于 28 恒温培养箱中静置培养 24 h 后,观察抑菌情况。参照李成海等17 的判断方法,结果用“+”或“”表示。1.2.5菌株的分子鉴定及系统发育树构建1)16S rNA 基因鉴定。将菌株发酵液以4 300 g 离心5 min,弃上清液,菌体用 PBS 缓冲液离心洗涤 2 次后,用细菌基因组提取试剂盒提取细菌 DNA 天根生化科技(北京)有限公司。以提取的细菌 DNA 为模板,采用细菌 16S rNA 序列扩增的通用引物 27F(5 AGAGTTTGATCMTGGCT-CAG 3)和 1492(5 GGTTACCT
13、TGTTACGACTT3)进行 PC 扩增。PC 反应体系(共 25 L):ddH2O 9.5 L,DNA 模板 1.0 L,上、下游引物各1.0 L,Premix Ex Taq 12.5 L 宝生物工程(大连)有限公司。PC 扩增条件:94 下预变性 10 min;94 下变性 50 s,55 下退火 30 s,72 下延伸 1.5 min,共进行 35 个循环;最后在72 下再延伸 10 min。PC 产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,将测序结果用NCBI 数据库的 BLAST 进行同源性比对,采用MEGA 7.0 软件将菌株与同源性较高的其他菌株序列进行多重序列比较,并通过
14、邻接法构建系统发育树,初步判定菌株种类。2)gyrB 与 rpoD 基因鉴定。反应体系(共25 L):ddH2O 9.5 L,DNA 模板 1.0 L,上、下引物各 1.0 L(表 1),Premix Taq 酶 12.5 L。扩增条件:95 下预变性 10 min;95 下变性30 s,55 下退火30 s,72 下延伸60 s,共进行422大连海洋大学学报第 38 卷35 个循环;最后在 72 下再延伸 7 min。PC 产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,将测序结果用 BLAST 进行同源性比对,选取同源性较高的其他菌株基因序列,结合标准菌株相应的基因序列进行多重序列比对,并
15、通过邻接法构建系统发育树。表 1试验引物及序列Tab.1Primers and their sequences used in the experiment基因gene引物序列(5-3)primer sequence(5-3)参考文献referencegyrBF:TCCGGCGGTCTGCACGGCGT:TTGTCCGGGTTGTACTCGTCYez 等18 rpoDF:GAAGGCGAAATCGACATCGC:ATGCTCATGCGCGGTTGATSenderovich 等19 1.2.6菌株生化鉴定参考 Khalifa 等20 的方法,采用 Biolog Gen 微生物鉴定系统(Biolo
16、g,美国)对菌株 02HN 进行生理生化鉴定。以杀鱼假交替单胞菌 2515 为参考菌株,具体操作步骤参考 BiologGen MicroPlate 使用说明书,采用 Microlog 3 软件读取试验结果。1.2.7菌株 02HN 对对虾的生物毒性测试采用2216E 海水培养基摇瓶发酵菌株 02HN、副溶血弧菌和枯草芽孢杆菌 24 h,发酵液经 4 000 g 离心10 min,将离心后的沉淀用 PBS 洗涤 2 次备用。采用浸泡攻毒方法评价菌株 02HN 对对虾的安全性,将暂养 1 周的健康凡纳滨对虾分别置于 16 个有效水体为 20 L 的水槽中,每个水槽中放对虾 10 尾。试验设菌株 0
17、2HN 组、阳性对虾组、阴性对照组和空白组 4 个组。其中,菌株 02HN 组,设置菌株终浓度分别为 1.70108、1.70107、1.70106、1.70105、1.70104CFU/mL;阳性对照组为副溶血弧菌组,设置菌株终浓度分别为 1.55108、1.55107、1.55106、1.55105、1.55104CFU/mL;阴性对照组为枯草芽孢杆菌组,设置菌株终浓度分别为1.58 108、1.58 107、1.58 106、1.57 105、1.56104CFU/mL;空白对照组只添加 PBS。浸泡感染 24 h 后正常投喂、吸污、日换水 50%,养殖水温为(26.029.0),pH
18、为 7.80.5,盐度为32。每日记录对虾死亡情况,至各组对虾稳定后,统计对虾累计死亡率。整个感染试验重复两次,采用 SPSS 16.0 软件计算对虾的半致死浓度(LC50),安全浓度定义为 LC50的 1/10。1.2.8菌株 02HN 的溶血活性28 条件下于2216E 平板上接种菌株 02HN 及对照用杀鱼假交替单胞菌 2515,培养 24 h 后刮取菌落,分别用 PBS制成浓度为 1.90109CFU/mL、1.75109CFU/mL的菌悬液,各取 5 L 等距点种在羊血和鱼血琼脂平板上,每种菌株设 3 个重复。于 28 恒温培养箱中培养 48 h,观察溶血情况。1.2.9菌株 02H
19、N 在对虾养殖中的抑菌效果试验1)饲料制备及试验设计。参照王枫林等21 的方法进行饲料制备。通过摇瓶发酵菌株 02HN 获取菌体,采用平板涂布法测定 02HN 发酵液浓度后,按照含量 1105、1107cells/g 将 02HN 发酵菌液添加到对虾原饲料中,以质量分数为 1%的褐藻酸钠为黏合剂进行制粒,作为试验组饲料,空白对照饲料不添加菌株,在常温下晾干备用。试验设置 2 个含菌饲料投喂组(含菌株 02HN1105、1107cells/g 饲料),另设 1 个空白对照组,投喂不含菌株的饲料。每个处理组设置 4 个重复,其中 1 个组用于补齐其他 3 个组采样后的对虾数量。对虾养殖于体积为 6
20、0 L 的水族箱中,有效水体为40 L,每个箱内随机放养 30 尾健康凡纳滨对虾。各组每天按照饲料量的 70%添加蔗糖,以培养生物絮团控制养殖池水体中的氨氮含量22,每日投喂 3 次,日投喂量为对虾体质量的 3%,试验的第一周不换水,之后每天换水 10%。养殖期间水温为(27.02.2),盐度为 32.11.8,连续充气。2)对虾肠道及肝胰腺中的弧菌定量。于养殖试验开始后的第 3 天和结束时(第 28 天),从各组取样,分析其肠道及肝胰腺中的弧菌数量,取样前 12 h 停止投喂。从每组随机取对虾 3 尾,无菌条件下剪取部分对虾肠道和肝胰腺,精确称重后加入 10 倍质量的 PBS 缓冲液并充分研
21、磨,再进行 10倍梯度稀释(肝胰腺样品进行 101 103倍稀释,肠道样品进行 102104倍稀释),取每个稀释后的样品 100 L 涂布于 TCBS 平板上,28 下恒温培养 24 h 后,取菌落数为 10100 的平板计数。每个样品涂布 3 个平行样。3)对虾存活率及生长率测定。在养殖试验结束时,记录每组虾的存活数,统计各组虾的生物学体长,并 计 算 存 活 率(S,%)和 体 长 增 长 率(GBL,%)。计算公式为S=Nt/N0100%,GBL=(LtL0)/L0100%。其中:Nt为试验结束时对虾存活的数量(ind.);N0为试验初始时对虾的数量(ind.);Lt、L0分别为试验结束
22、时和初始时对虾的体长(cm)。4)生物絮团定量。养殖试验结束时,对养殖水体中生物絮团量进行测定,在距离水面 20 cm处,用灭菌的 50 mL 离心管取 3 个不同点的水样各522第 2 期朱娜,等:一株虾源假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)的分离鉴定及口服后对对虾体内弧菌的影响40 mL,以 4 000 g 离心 10 min 后弃上清液,取絮团湿质量进行称重后,计算絮团的浓度。2结果与分析2.1拮抗菌的筛选菌株 02HN 在 2216E 平板上的菌落形态为圆形,边缘整齐,橙黄色。用副溶血弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、欧文氏弧菌、溶藻弧菌和美人鱼发光杆菌测试菌株 02
23、HN 的拮抗作用(图 1),可见菌株 02HN 对 6 株致病菌的生长均具有一定的抑制作用,但抑制效果存在差异。测量菌株 02HN 对 6 株虾病原菌的抑菌圈直径,AF副溶血弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、欧文氏弧菌、溶藻弧菌和美人鱼发光杆菌。A-FV.parahaemolyticus,V.harveyi,V.cambellii,V.owensii,V.alginolyticus and P.damselae,respectively.图 1菌株 02HN 对 6 株虾病原菌的抑菌效果Fig.1Antibacterial effect of strain 02HN against 6strain
24、s of shrimp pathogenic bacteria结果显示,菌株 02HN 对病原菌抑制效果最强的是哈维氏弧菌,其次是欧文氏弧菌,溶藻弧菌的抑菌圈直径最小(表 2)。表 2菌株 02HN 对不同病原菌的拮抗效果评价Tab.2Evaluation of antagonistic effect of strain 02HNagainst different pathogenic bacteria病原菌株pathogenicstrain抑菌圈直径/mmdiameter ofinhibition zone抑菌效果antibacterialeffect副溶血弧菌(V.parahaemolyt
25、icus)25.400.30+哈维氏弧菌(V.harveyi)31.250.21+坎贝氏弧菌(V.cambellii)22.670.85+欧文氏弧菌(V.owensii)26.101.04+溶藻弧菌(V.alginolyticus)17.300.30+美人鱼发光杆菌(P.damselae)20.570.35+注:+表示高度抑菌效果,定义直径20 mm;+表示中等抑菌效果,16 mm直径20 mm;+表示弱抑菌效果,7.8 mm直径16 mm;表示无抑菌效果,直径=7.8 mm。Note:+means highly bacteriostatic,and the defined diameter
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