扎那纹胸鮡g型溶菌酶的cDNA克隆及组织表达分析.pdf
《扎那纹胸鮡g型溶菌酶的cDNA克隆及组织表达分析.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《扎那纹胸鮡g型溶菌酶的cDNA克隆及组织表达分析.pdf(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)711网络出版时间:2023-04-21 17:02:52 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.r.20230420.1338.002.h t ml扎那纹胸銚g型溶菌酶的cDNA克隆及组织表达分析王运娇,吕 梦,蔡莎莎摘要 目的 鉴定扎那纹胸觥g型溶菌酶(GzLy sG)编码序 列,分析其在宿主免疫系统中的作用。方法通过巢氏P CR 技术克隆了 GzLy sG c DNA 序列,通过 Ex
2、 P ASy、Sig n a l P 5.0、CDD、Cl u st a l Ome g a等在线软件对GzLy sG蛋白进行生物信 息学分析,利用RT-q P CR技术分析了 GzLy sG mRNA在不同 组织中的表达情况。结果 GzLy sG c DNA的开放阅读框全 长558 b p,编码185个氨基酸,其蛋白序列分子量为20 47&20 u,理论等电点为9.16,是一种稳定的碱性亲水性蛋 白质。该蛋白无信号肽,含有g型溶菌酶典型的催化活性位 点、GEWL结构域和SLT结构域。高级结构分析发现,GzLy sG蛋白以a螺旋和无规则卷曲结构为主,其分子表面 有一条与溶菌酶活性密切相关的狭长
3、裂缝。系统进化分析 表明溶菌酶在物种进化过程中较为保守,且GzLy sG与斑马 鱼来源的溶菌酶表现出较近的亲缘关系。组织表达谱分析 发现,GzLy sG mRNA在免疫保护相关的皮肤、肌肉和鲍组织 中具有较高表达量。结论GzLy sG在扎那纹胸觥固有免疫 防御中可能发挥重要作用。关键词扎那纹胸銚;g型溶菌酶;生物信息学分析;组织表 达谱中图分类号Q956文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0711-07 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.002溶菌酶最初以水解细胞壁而闻名,根据分子 结构、催化机制及免疫特性的
4、不同,动物溶菌酶分为 3种:c型溶菌酶、g型溶菌酶和i型溶菌酶。鱼类 溶菌酶主要有c型溶菌酶和g型溶菌酶2种,且这2 种类型的溶菌酶在组织分布、基因组结构和分子特 征方面都存在很大的不同。目前针对鱼类溶菌 酶的研究主要集中在c型,对g型溶菌酶的报道局 限于鲤形目鲤鱼、草鱼,餉形目石首鱼科、鮪 科,詢形目歸科,鳏形目牙鲫科和鳗形目2022-12-18 接收基金项目:国家自然科学基金(编号:31900328);济宁医学院教育教 学研究项目(编号:Y2020018)作者单位:山东第一医科大学(山东省医学科学院)研究生院,济南250000作者简介:王运娇,女,硕士研究生;蔡莎莎,女,副教授,硕士生导师
5、,责任作者,E-ma il:bio-c a ish a sh a ma il.jn mc.ed u.c n 科等。目前尚无关于鮎形目觥科鱼溶菌酶的报 道研究。扎那纹胸銚隶属銚科、纹胸觥属主要分布 于我国澜沧江中游及怒江上中游水网系统,是当地 重要的经济渔获之一。近年来,由于过度捕捞、栖息地退化或环境污染,该物种的自然种群数量急 剧下降,引起人们对其长期可持续性的日益关注。人工驯养是保护扎那纹胸銚种质的一种可行方式,但目前扎那纹胸觥的人工养殖技术还不成熟,难以 实现规模化,且常有各种感染性疾病的发生。鉴于 溶菌酶在鱼类感染性疾病控制中的重要作用,该 研究利用P CR克隆和生物信息学的方法分析鉴定
6、 T扎那纹胸觥g型溶菌酶(G.zainaensis g-type Lyso-zy zn e,GzLy sG)基因,并利用实时定量P CR技术分析 了其在扎那纹胸觥不同组织中的表达特征,为进一 步阐明g型溶菌酶在扎那纹胸銚免疫防御抵抗病原 菌中的功能奠定了重要基础。1材料与方法1.1实验动物 扎那纹胸銚6条,4雄2雌,体质 量100-200 g,采自四川怒江,液氮速冻,干冰运输。解剖取其肝脏、肠、肌肉、鲍、皮肤和脾脏组织,置于 液氮中,保存备用。1.2药品与试剂TRIzo l RNA分离试剂购自美国 In v it r o g en 公司;SMARTTM c DNA Libr a r y Co
7、n st r u ct io n Kit(Cl o n t ec h)、P r imeSc r ipt RT r ea g en t Kit w it h g DNA Er a ser(P er f ec t Rea l Time)、TB Gr een P r emix Dimer Er a ser(P er f ec t Rea l Time)以及 P CR 克隆用 的Ta q酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;引物合成、测序由上海生工生物工程有限公司完成。1.3方法1.3.1扎那纹胸銚溶菌酶基因的克隆利用TR-Izo l RNA分离试剂提取扎那纹胸銚肝脏组织总 RNA,分别利用1%琼脂
8、糖凝胶电泳和Na n o Dr o p GX 分光光度计分析RNA的完整性和纯度。选以高质 量的RNA为模板,严格按照说明书要求,利用建库 试剂盒 SMARTTM c DNA Libr a r y Co n st r u c t io n Kit 构 建c DNA文库。参考已知鱼类g型溶菌酶的基因序 列,借助P r imer P r emer 5.0在线软件,设计两条5,上 712安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)游弓I 物(P l:5,-ATGGCTKGCATn TTGGAGAC3,P 2:5 ATGAT
9、CTGAAGARGATGGA-3),然后利用试 剂盒内的CDSHI/3,P CR P r imer为3,随机引物进行 目的基因的P CR克隆,挑选阳性克隆测序,将测序 结果序列与NCBI数据库中的序列进行比对鉴定分 析。1.3.2生物信息学分析使用Ex P ASy中的Tr a n sl a t e 软件(h t t ps:/w e b.ex pa sy.o r g/t r a n sl a t e/)推导氨 基酸序列。对推导的氨基酸序列,利用Sig n a l P 5.0 Ser v er(h t t ps:/ser v ic es,h ea l t h t ec h.d t u.d k/se
10、r v ic e,ph p?Sig n a l P-5.0)进行信号肽的査找分析。利用在线软 件 P r o t P a r a m(h t t ps:/w eb.ex pa sy.o r g/pr o t pa r a m/)对溶菌酶序列的理化性质进行分析。利用CDD(h tt ps:/w w w.n c bi.n l m.n ih.g o v/St r u c t u r e/c d d/w r psb.c g i)分析溶菌酶的保守结构域。在NCBI中查找已 报道的其他物种来源的溶菌酶的序列信息,利用 Cl u st a l Omeg a(h t t ps:/w w w.ebi.a c.u
11、 k/To o l s/msa/c l u st a l。/)在线软件对扎那纹胸觥溶菌酶与其他物种 的氨基酸序列进行多物种序列比对。利用MEGA 6.0软件,选以邻接法构建系统发育树,参数设置选 择 P o isso n Co r r ec t io n 模型,bo o t st r a ps 设置为 1 000。1.3.3结构分析 利用在线预测软件SOP MA(h tt ps:/n psa-pr a bi.ibc p.f r/c g i-bin/n psa _ a u t o ma t.pl?pa g e=n psa _so pma.h t ml)分析蛋白的二级结构。利用 SWISS-MOD
12、EL(h t t ps:/sw issmo d el.ex pa sy.o r g/)预测扎那纹胸觥溶菌酶的高级结构。1.3.4组织表达谱分析 按照“1.3.1”所述方法 提取扎那纹胸銚脾脏、肝脏、肠、肌肉、鲍和皮肤6个 组织的总RNA,然后按照P r imeSc r ipt RT r ea g en t Kit w it h g DNA Er a ser(P er f ec t Rea l Time)试剂盒说 明书,合成c DNA链序列。反转录的c DNA模板 用EASY Dil u t io n稀释10倍后使用。利用P r imer P r emer 5.0软件设计扎那纹胸銚溶菌酶基因和内
13、参 基因p-a c t in的引物。GzLy sG的上下游引物分别为 5,-AGTACAAGGCCACCATCGTC-3,和 5,-TCACTGT-TCCAGGCTCCTIT-3,3-a c t in的上下游引物分别为 5,-GCTGTCTTCCCTTCCATTGT-3,和 5,-CTGAGCCT-CATCACCAACAT-3。按照 TB Gr een P r emix Dimer Er a ser (P er f ec t Rea l Time)试剂盒说明书在 Qu a n t-St u d io 7 Fl ex r ea l-t ime P CR Sy st em(Appl ied Bio
14、 sy s-t ems,USA)上进行q P CR反应。反应体系为:12.5|jl1 的 TB Gr een P r emix Dimer Er a ser(2 X),0.75|il 的 P CR Fo r w a r d P r imer(10(x mo l/L),0.75(x l 的 P CR Rev er se P r imer(10|x mo l/L),2 pil 的模板 c DNA,9|x l 的灭菌双蒸水。q P CR的反应条件为:95咒预变性 30 s;40 个循环,95 C变性5 s,60 C退火30 s,72 C 延伸30 s。各样品的目的基因反应产物经熔解曲线 确认是否为单
15、一特异性的扩增条带。目的基因的转 录水平变化采用AACt法分析处理。1.4 统计学处理 所有的数据采用Gr a ph P a d P r ism 5.0软件进行统计分析并作图。数据以x s 的形式表示。利用非配对t检验分析两组样本间是 否存在显著性差异性。P 0.05示差异有统计学意 义。2 结果2.1 GzLysG cDNA的克隆及分子特征 以肝脏 总RNA为模板,利用巢氏P CR技术,成功克隆到一 条编码GzLy sG的全长c DNA序列(Gen Ba n k登录 号:OP 881998,图1)。按照溶菌酶的类型和扎那纹 胸觥拉丁名G.za in a en sis的前两个首字母将克隆得 到
16、的溶菌酶命名为GzLy sGo GzLy sG的c DNA序列 全长558 bp,编码185个氨基酸(图1)。蛋白保守 功能结构域的预测结果表明,GzLy sG含有g型溶菌 酶典型的鹅蛋清溶菌酶(g o o se eg g w h it e l y so zy me,GEWL)结构域和可溶性裂解转糖昔酶(so l u bl e l y t ic t r a n sg l y c o sy l a ses,SLT)结构域。GzLy sG蛋白无信号肽序列,表明该溶菌酶为非 分泌表达的蛋白质(图2)。GzLy sG蛋白的氨基酸 序列中含有20种常见氨基酸,其中Ly s的含量最高(11.9%),其次是
17、6血(10.8%)和 Al a(8.1%)。其 分子量为20 47&20 u,理论等电点为9.16,经Ex-P ASy-P r o t P a r a m分析判断为一种稳定的碱性亲水性 蛋白质。2.2多物种溶菌酶基因序列比对多物种序列比 对结果发现,GzLy sG与日本鳗麵(AJLy sG2)和斑马 鱼(DRLy sG)来源的溶菌酶的同源性相对较高。且 在GzLy sG序列中也发现了 g型溶菌酶高度保守的 催化活性位点 Gl u(E73)、Asp(D86)和 Asp(D97)(图3)。2.3 GzLysG的结构特征分析GzLy sG二级结构 中含有6个大小不一的a螺旋结构,占比43.24%,B
18、折叠占比11.35%,p转角占比4.86%,无规则卷 曲结构占比40.54%(图4A)Sw iss mo d el模型进 一步验证了上述结果,GzLy sG与鹅蛋蛋白溶菌酶(P DB:1531.1.A)结构相似,都有6个a螺旋结构(图4B)O3D结构模型显示,GzLy sG分子表面有一安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)713II Ig g cRM艸iMC艸Id c ia a egM1)h取Il e aCULie t cdCCg l lg g gg igg a gCr l lc iaEiCig120a a g
19、a a gk1AIIL40gitiig iif iIc tCc it ef il et ic iag t 1咏iiitd180DLEG60Hl gRMc u aHCfgigg elHitteet e e f ig g g if g g HCH g l I Cl t2WD PA 1 IRV.HOn a H kw Lg g g f;h g Eic rhh g g c;itt c g耳r 11 c krh cIe t il clik g L I f f d f n u g h.rh i:h300VI.K100DEGGc u er IClWCL鼎r idCHgtKHgKHCHHIl l e g l.C
20、KMCMlC:I.M360IITpKGAwsEDNIVQGTI)1L120HIr il itH I f.:Ct t HHt.1HHHliec c ga g et g HC-i.:f ia gg gc a ttlt120I)F1KQIuKKFlJSwTKliQH1140Kglg RHa t et e ag eeI a tt ia c耳取g g cgeeg g t ia a tg l ct-g-昨t a t腳耳 曰 G I P G、U Y S I!D A R A Q W F 180:80(43,24%)3D(Gg):0(O.f MP o)乔螺旋(iir:o(n,o w-f t)为桥(Bb:0(GO
21、O%)延伸链(Ee):21(11,35%)卜转角):9 弯 I1U 区域():0(0.00%)无规则卷曲):75(40.54%)模糊状态(?):0(0W%)其他状态4(0.0OT1)lllfl il l l l l il Nl il l Ul tl l|”州1川1恤|仰11川川l l bl j|:PNI11iHiiiiimllU图4 GzLysG的结构预测结果A:GzLy sG的二级结构预测结果;B:GzLy sG的3D结构模型;催化位点残基Gl u(73)、Asp(86)和Asp(97)以点和洋红色表示安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui
22、 2023 Ma y;58(5)715 BAB 17215.1(P M泊ac eufi)NP 0010279H4.1(I w bn pM99988AF75844.1(S.祐呦执闵-ABY84356 1(S 阳和却崩)AIZ00421.1(A;a j9&n/Ga)-P DBB05 2(M.r n t r sGu伽)AAL69327.1(G.100AAO1868.1(B.)ACF41166.1(C.WJa)WONP63imi(D.r ar i0)100 I93CAA21317.1 QABD65296 1(p,v a n n a mer)AAR29291.1(A r u bef l司99100100
23、AAN16208.1(f i.a zo f l eu s)-AAASB144.1(H medicmaiis)-ABC6B610.1(Ef f n c l l r e/)AIZ00422.1 护 J白po 曲 a s)AAH29126.1 H.甜酬胡时AAIDD8S6.1(Hsa pr en s)83NP 001028699.1(M.9583o.i9899-NP 001027764 1(I 呻)AAI34160.1(a n s-MAAH7609S.1(D.血o)-GztysGAAU81661.1!(G.mw h w e)-ABV66O69.1(L EZ居98 L86BAF75B4&.1(S.r
24、i?o miW5)AALO8O21.2.心駅如BAA95698 1(C,日审明-i型98 LAAUS-689S 1(S.咖希)图5 GzLysG的进化分析6所示,GzLy sG基因在多个组织中均有表达,其在不 同待检组织中的表达量差异性较大。GzLy sG基因 在皮肤中的表达量最高,表达量约为在肠中表达量 的633倍;在肌肉和鲍中的表达量次之,分别为在肠 中表达量的476和81倍;其在肝脏、脾脏和肠中的 表达量较低。3讨论近年来,随着水产养殖生态环境的恶化,鱼类病 害发生率居高不下。水产养殖对于抗生素的过度依 赖已在全球范围内造成了严重的微生物耐药性问 题。因此,提高鱼类自身免疫防御能力,研发
25、安全高图6 GzLysG mRNA在扎那纹胸銚不同组织中的相对表达量1:肠;2:肝脏;3:肌肉;4:脾脏;5:皮肤;6:鲍;以3-a c t in基因为内参,与肠组织比较:*P 0.05,*P 0.01 716安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)效的抗生素替代品,是鱼类疾病防控的未来研究方 向。相较于特异性免疫,非特异性免疫系统在鱼 类抵抗病原菌时发挥更为重要的作用3。作为宿 主重要的非特异性免疫因子,鱼类溶菌酶因具有广 谱、高效、生物安全的抗菌活性在防治水生动物病害 方面展现出良好的应用前景210o本研究通
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 纹胸鮡 型溶菌酶 cDNA 克隆 组织 表达 分析
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。