稀土铽离子介导的非标记适配...器评估食品中的重金属银污染_杨淏.pdf
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1、现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 284 稀土铽离子介导的非标记适配体传感器评估食品中的重金属银污染 杨淏1,徐依琳1,孙思瀚2,高鸿1,邓锐杰1*(1.四川大学轻工科学与工程学院,四川成都 610065)(2.抚顺市食品检验检测中心,辽宁抚顺 113000)摘要:作为最具毒性的重金属之一,银在食品和环境中的污染对人体健康会造成严重危害。该研究基于稀土铽离子(Tb3+)能够结合单链DNA 发出特征荧光的原理,利用 Ag+能与胞嘧啶(C)结合形成C-Ag+-C 结构以组成双链DNA 的特性,构建了一种特异性识别
2、Ag+的非标记核酸适配体荧光传感器。该传感器通过 Tb3+对单双链 DNA 结构变化灵敏的特征荧光响应,能够实现对 Ag+的高灵敏和快速的定量检测。该方法对 Ag+的检测限为 391.50 nmol/L,满足国家对于饮用水中 Ag+限量检测的要求(0.05 mg/L,即 463.50 nmol/L)。该方法的回收率测定结果在 93.02%102.72%范围内,其相对标准差范围为 1.27%7.14%,证明了它的应用有效性;相较于其他的分子检测方法,该方法具有无需进行化学标记以降低成本,且操作简便,检测响应速度快等优点,为临场快速检测重金属银污染提供了一种可能的途径。关键词:重金属;银;稀土铽离
3、子;核酸适配体;食品安全 文章编号:1673-9078(2023)06-284-289 DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.6.1597 Assessment of Silver Contamination in Food Using Tb3+-mediated Label-free Aptasensor YANG Hao1,XU Yilin1,SUN Sihan2,GAO Hong1,DENG Ruijie1*(1.College of Biomass Science and Engineering,Sichuan University,Chengdu 61
4、0065,China)(2.Fushun Food Inspection and testing Center,Fushun 113000,China)Abstract:As one of the most toxic heavy metals,silver(Ag+),when contaminating food or the environment,causes serious harm to human health.Based on the principle that terbium ions(Tb3+)can combine with single-stranded DNA(ssD
5、NA)to emit characteristic fluorescence,this study took advantage of the ability of Ag+to combine with cytosine(C)to form a C-Ag+-C structure that enables the formation of double-stranded DNA(dsDNA),and a label-free fluorescent nucleic acid aptasensor was constructed that specifically recognizes Ag+.
6、This sensor achieved the highly sensitive and rapid quantitative detection of Ag+through the characteristic fluorescent response of Tb3+,which is sensitive to the structural change of ssDNA to dsDNA.The detection limit of Ag+in the proposed method is 391.5 nmol/L,which meets the national requirement
7、 for the detection of Ag+in drinking water(0.05 mg/L,i.e.,463.5 nmol/L).The recovery rate of this method ranges of from 0.02%to 102.72%,and the relative standard deviation ranges from 1.27%to 7.14%,which proves the effectiveness of the method.Compared with other detection methods,the proposed method
8、 does not require chemical labeling to reduce costs,is easier to operate,and has a fast detection response,thereby providing method for the rapid on-site detection of silver contamination.Key words:heavy metals;silver;Tb3+;aptamer;food safety 引文格式:杨淏,徐依琳,孙思瀚,等.稀土铽离子介导的非标记适配体传感器评估食品中的重金属银污染J.现代食品科技,2
9、023,39(6):284-289.YANG Hao,XU Yilin,SUN Sihan,et al.Assessment of silver contamination in food using Tb3+-mediated label-free aptasensor J.Modern Food Science and Technology,2023,39(6):284-289.收稿日期:2022-12-20 基金项目:国家自然科学基金面上项目(22074100)作者简介:杨淏(1995-),男,研究生,研究方向:食品安全;E-mail:hyang_ 通讯作者:邓锐杰(1990-),男,博
10、士,副研究员,研究方向:食品安全,E-mail: 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 285 重金属富集于土壤、水等环境和食物中,因其持久的生物累积性和不可降解性,能通过食物链累积至人体,对人体健康造成严重损害1。其中,银污染近 年来受到广泛关注,由于其良好的光、电学特性,它被广泛应用于医疗成像、摄影、电子等各个行业2,且银也常用于生活饮水及洗漱用品的消毒杀菌3,这也导致了大量含有 Ag+的废水被排放到环境中4。研究表明,若人们长期暴露于高浓度的 Ag+环境中,会导致大脑、神经和免疫系统方面的各类疾病5,因为它能
11、与各类细胞代谢物结合并使巯基酶失活6。因此,建立能够灵敏、快速检测环境与食品样品中 Ag+浓度的方法是当下重金属污染控制领域的重要任务。目前 Ag+检测方法主要有电感耦合等离子体质谱法7、荧光光谱法8、电化学分析法9和原子吸收光谱法10等,它们准确性高,但都具有样本前处理复杂,检测耗时过长等局限。随着功能核酸在小分子靶标检测中的应用逐渐被开发,其中基于核酸适配体识别的新型检测方法引起了较大关注11,12。二十世纪末,Ellington 等13和 Tuerk14等运用配体指数级富集系统进 化 技 术(Systematic Evolution of Ligands by EXponential E
12、nrichment,SELEX),筛选出了一些随机寡核苷酸,它们能特异性结合某些小分子或大分子,比如金属离子、真菌毒素、蛋白质和细胞,此类具有靶分子特异识别性的特殊单链核酸片段被Ellington等命名为核酸适配体(Aptamer)。Aptamer 具有可编程性、合成成本低、特异性高、结合力强、靶分子广等优点,非常适合于食品临场快速检测技术的开发15,16。本研究利用了 Aptamer 及稀土铽离子(Tb3+)与单链核酸结合可发出特征荧光的原理设计了一种检测Ag+的非标记 Aptamer 探针17。Tb3+在溶液中与双链共存,或是独立存在于溶液中时不发光,当体系中存在单链核酸时,Tb3+可与之
13、结合发出特征荧光18。这是因为 Tb3+的吸收截面较小,其单独存在时较难观察到特征荧光,通常需要其与配体结合,发生能量转移来增敏荧光19。Tb3+在 DNA 上共有 2 个结合位点,分别是碱基上的电子给予体和磷酸骨架上的氧负离 子20。在双链 DNA 中,Tb3+主要与磷酸基团结合,特征荧光受到抑制;若 DNA 中碱基无法完全配对,Tb3+则同时与两个结合位点结合,使得特征荧光显著增强21。本方案利用 Ag+可以诱导“C-Ag+-C”结构的形成从而使得单链结构转变为双链这一特点22,在Aptamer 溶液中加入 Ag+后,Tb3+无法再结合电子给予体,荧光增强受到抑制。利用这一荧光强度变化建立
14、了定量检测 Ag+的分析方法,且本检测体系中只需用到一条无需荧光标记的 Aptamer,所需材料简单,大大节约成本,且检测过程在均相溶液中即可完成,本方法给 Ag+的临场快速检测设计提供了新思路。1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂 荧光多功能酶标仪 Synergy H1,美国伯腾仪器有限公司。DNA 核酸适配体序列购自生工生物工程(上海)股份有限公司,DNA 适配体的合成采用固相亚磷酰胺三酯法,该方法是在固相载体上,沿 35的方向依次添加核苷酸完成 DNA 链的合成,合成后的 DNA 序列选择 PAGE 进行纯化。本实验所用到的 DNA 核酸序列见表 1。硝酸铽与硝酸钠购自上海源叶生物科技
15、有限公司。实验用水为分子生物级用水,购自美国康宁(Corning)公司。1.2 实验方法 1.2.1 溶液的配制 将盛有核酸干粉的离心管置于离心机中,在 8 000 r/min 下离心 3 min 后,加入超纯水配置成 10 mol/L 的核酸溶液。在10 mL超纯水中加入2.175 1 g五水硝酸铽并充分溶解,配置成 500 mmol/L 的铽离子溶液,实验前根据需要进行不同的浓度稀释。在 4 环境下保存,缓冲溶液配制为 1 mol/L 的 NaNO3溶液。1.2.2 靶标 Ag+的检测 在离心管中个加入终浓度为 2 mol/L Ag+核酸适配体、150 mmol/L NaNO3缓冲液和不同
16、浓度的 Ag+标准溶液(0、1、2、6、8、10、50、75、100 mol/L),定容至 36 L,混匀静置 10 min 后加入 4 L 500 mmol/L Tb3+溶液,静置反应 5 min 后放入多功能微孔板检测仪中测定荧光强度,激发波长设置为 290 nm,发射波长范围设置为 450650 nm。1.2.3 选择性测试 为了验证该方法对于 Ag+的检测特异性,选择了Pb2+、Cu2+、Co2+、Mn2+和Mg2+作为干扰离子与Ag+的输出荧光进行对比测试。选择性测试共选择了 3 个浓度,分别为1、5、10 mol/L。荧光检测参照1.2.2 步骤。1.2.4 食品样品中 Ag+的检
17、测(1)样品制备:用自来水直接配制不同浓度的Ag+溶液(30、60、90 mol/L)。(2)荧光测定:4 L 样品溶液、6 L NaNO3 buffer(1 mol/L)、4 L Ag+核酸适配体(20 mol/L),混匀,室温反应10 min 后加入 4 L Tb3+溶液(500 mmol/L),现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 286 混匀并反应 5 min,将混合溶液注入到 384 孔板中,用多功能微孔板检测仪对其进行荧光检测,记录在545 nm 处的荧光值,根据实验所得标准曲线计算出样品液中 Ag+浓
18、度。(3)回收率计算:将用本方法检测所得 Ag+浓度除以对应真实添加的 Ag+浓度获得检测回收率。1.2.5 数据分析 本文涉及的所有试验均重复测定 3 次,数据处理采用 Microsoft Office 和 OriginPro 8.5 软件进行。2 结果与讨论 2.1 核酸适配体检测银离子原理及验证 本方法利用 Tb3+特征荧光实现了非标记检测,且只涉及一条单链核酸适配体,避免了复杂的核酸探针结构的设计。检测原理如图1 所示,Tb3+特异性结合单链核酸适配体后点亮Tb3+的特征荧光;另外,Ag+可以特异性介导胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(C)形成C-Ag+-C复合物,该复合物类似于一种DNA 双链结
19、构。如图1所示,当溶液中有银离子存在时,银离子与适配体中胞嘧啶结合,形成C-Ag+-C 结构。因而当Ag+存在时,富含胞嘧啶的单链核酸适配体可通过 C-Ag+-C 相互作用形成一个相互杂交的双层结构,类似于DNA 双链结构,此时 Tb3+无法再结合电子给予体,荧光增强受到抑制,导致Tb3+特征荧光显著降低。Ag+介导的核酸适配体构象变化,导致荧光信号改变,可以以此定量检测Ag+。如图1 中的荧光测试结果所示,仅有单链核酸适配体与Tb3+存在时具有较高的特征荧光,而加入Ag+后,特征荧光显著降低,噪信比达到了约 5.21 倍。该荧光测试验证了本实验所设计的检测原理的可行性。图 1 Tb3+介导的
20、非化学标记的核酸适配体探针检测 Ag+的原理示意图及荧光光谱图 Fig.1 Schematic diagram and fluorescent spectraof label-free Tb3+-mediated aptasensor for detection of Ag+2.2 实验条件优化 图 2(a)不同适配体探针序列对 Ag+的荧光响应;(b)不同适配体探针浓度对 Ag+的荧光响应;(c)适配体探针在不同Tb3+浓度下对 Ag+的荧光响应 Fig.2 Fluorescence intensity and background-to-signal ratio of the aptase
21、nsor response to Ag+using(a)different aptamers,(b)different concentrations of aptamer and(c)different amounts of Tb3+本实验方法无需进行核酸标记,且仅设计一条单链核酸适配体序列,因而条件优化过程较为简单。对3 个条件进行了优化,分别是核酸适配体序列优化、核酸适配体浓度优化和 Tb3+浓度优化。首先,选择了现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 287 5 条富含不同胞嘧啶个数(8、10、12、14、16
22、)的核酸适配体进行荧光分析(如表 1),结果显示(如图 2a),3末端含有 14 个胞嘧啶的适配体(Atp3)得到的噪信比最高,达到了 6.65。其次,关于核酸适配体浓度,分析了 0.1、1、2、5、10 mol/L 的荧光结果,表明(如图 2b),终浓度为 5 mol/L 时可获得最高的噪信比(11.18)。另外,Tb3+的特征荧光也是影响实验结果的关键因素,对比 5 个 Tb3+终浓度(1、5、10、25、50 mmol/L)后发现,5 mmol/L 的 Tb3+能够导致最高的信号响应,噪信比可达 23.64(如图 2c)。表 1 Ag+核酸适配体序列 Table 1 Sequences
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