长链非编码RNA_Linc...胶质瘤中的表达及其功能研究_王宇杰.pdf
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1、DOI:103969/j issn1672-7770 2023 02006胶质瘤基础长链非编码 RNA Linc00645 在脑胶质瘤中的表达及其功能研究王宇杰,李晨龙,郑宏山,刘清,艾思奇,王英杰,肖旭,苏天崎,付天娇,梁鹏【摘要】目的研究长链非编码 RNA Linc00645 在脑胶质瘤组织中的表达水平及其对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并探究其可能的作用机制。方法分析癌症基因组图谱(TCGA-GBM)数据库和中国脑胶质瘤基因组计划(CGGA)数据库中,Linc00645 在正常脑组织和胶质瘤组织中的表达情况,并采用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)在人正常星形胶质细胞株和 5
2、 种胶质瘤细胞株中检测 Linc00645 的表达水平。敲低 Linc00645 表达后,应用细胞增殖实验(MTT)检测胶质瘤细胞的增殖能力,应用划痕实验和 Transwell 侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力。应用 Western Blot 实验在蛋白水平上验证敲低 Linc00645 的表达对胶质瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白的影响。结果Linc00645 在脑胶质瘤中的表达水平明显高于正常脑(P 0 05),并且 Linc00645 的表达水平随着胶质瘤病理等级的升高而升高(P 0 05)。Linc00645 高表达组的患者,总体生存期明显缩短,预后较差(P 0 05)。抑制 Linc0064
3、5 的表达后胶质瘤细胞的增殖、侵袭以及迁移能力均明显下降。基因表达相关性(Pearson)分析显示上皮-间质样转化(EMT-like)相关标志物 N-钙黏蛋白(N-cadherin),波形蛋白(Vimentin)和锌指 E-盒结合同源异形盒因子(ZEB1)与 Linc00645 表达呈正相关性,而E-钙黏蛋白(E-cadherin)与 Linc00645 表达呈负相关性(P 0 05)。敲低 Linc00645 的表达后细胞中的 E-cadherin 表达水平升高,而 N-cadherin、Vimentin 和 ZEB1 表达水平明显降低。结论长链非编码 RNALinc00645 在胶质瘤组织
4、中高表达,并且其表达水平与肿瘤的恶性程度密切相关。Linc00645 可能通过升高N-cadherin、Vimentin 和 ZEB1 的表达水平从而提高胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。Linc00645 可能作为胶质瘤早期诊断和治疗的新靶点。【关键词】神经胶质瘤;长链非编码 RNA;侵袭;上皮-间质样转化【中图分类号】R739 41【文献标志码】A【文章编号】1672-7770(2023)02-0146-07Expression and function of long non-coding RNA Linc00645 in glioma WANG Yu-jie,LI Chen-long,ZHE
5、NG Hong-shan,et al Department of Neurosurgery,Harbin Medical University CancerHospital,Harbin 150001,ChinaCorresponding author:LIANG PengAbstract:ObjectiveTo investigate the expression of long non-coding RNA Linc00645 inglioma tissues and its effect on the proliferation,invasion and migration of gli
6、oma cells,and toexplore its possible mechanisms MethodsThe expression of Linc00645 in normal brain tissuesand glioma tissues in The Cancer Genome Atlas(TCGA-GBM)database and the Chinese GliomaGenome Atlas(CGGA)database were analyzed,and quantitative Real-Time Polymerase ChainReaction(qRT-PCR)was use
7、d to verify the expression in Normal Human Astrocyte and 5 glioma celllines After knocking down the expression of Linc00645,MTT assay was used to detect theproliferation capacity of the glioma cells,and the wound healing assay and the Transwell assay wereconducted to evaluate the migration and invas
8、ion ability of the cells Western Blot was performed toverify the effect of Linc00645 knockdown on the invasion and migration-related proteins of gliomacells at the protein level ResultsThe expression of Linc00645 in glioma tissues was significantlyhigher than that in normal brain tissues(P 0 05),and
9、 the expression of Linc00645 increasedalong with the advance of the pathological grade of glioma(P 0 05)In the Linc00645 high基金项目:黑龙江省自然科学基金资助项目(LH2021H080)作者单位:150001 哈尔滨,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院神经外科通信作者:梁鹏641J Clin Neurosurg,April 2023,Vol 20,No 2expression group,the overall survival period was significantly
10、 shorter and the prognosis was worse(P 0 05)After inhibiting the expression of Linc00645,the proliferation,invasion and migrationability of glioma cells were significantly reduced The Pearson correlation analysis showed that EMT-like related markers N-cadherin,Vimentin and zinc finger E-box binding
11、homeobox 1(ZEB1)werepositively correlated with Linc00645,while E-cadherin was negatively correlated with Linc00645(P 0 05)The expression of E-cadherin increased,while the expression of N-cadherin,VimentinandZEB1significantlydecreasedafterknockingdowntheexpressionLinc00645ConclusionsLong non-coding R
12、NA Linc00645 is highly expressed in glioma tissues,and itsexpression is closely related to the malignancy of the tumor Linc00645 could increase the expressionof N-cadherin,Vimentin and ZEB1 to enhance the invasion and migration ability of glioma cellsTherefore,Linc00645 may serve as a new target for
13、 early diagnosis and treatment of gliomaKey words:glioma;long non-coding RNA;invasion;epithelial-mesenchymal transition-like在过去的几十年中,神经胶质瘤已成为中国乃至全球中枢神经系统恶性肿瘤相关死亡的主要原因1。尽管在诊断和治疗方面取得了很多进展,但神经胶质瘤患者的预后仍然很差,中位总生存期为12 14 个月。胶质瘤的发病率不断上升且病死率很高,因此迫切需要阐明其发展的病理机制。众所周知,胶质瘤发生的过程很复杂,涉及很多基因突变和 生 物 过 程 的 多 个 步 骤2 4
14、。上 皮 间 质 转 化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是促进肿瘤侵袭和迁移过程的重要机制5。长链非编码 RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一类 RNA 转录物,长度大于 200 个核苷酸,没有编码蛋白质的功能 6。LncRNAs 以前被认为是转录噪声,然而现已发现它们在一系列生物学过程中起着关键作用,如表观遗传调控,组蛋白修饰,转录控制和 RNA 代谢等过程 7。长链非编码 RNA 00645(Linc00645)位于人类14 号染色体上,已在子宫内膜癌中被证实有表达异常并发挥重要作用 8,然而 Linc00645
15、在胶质瘤中的作用尚不清楚。本研究检测了Linc00645 在脑胶质瘤组织中的表达水平,随后检测敲低 Linc00645 的表达对胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力及相关标志物的影响,明确 Linc00645 在胶质瘤发生发展中的作用,为神经胶质瘤的治疗提供一种新的策略。1资料与方法1 1数据库样本数据收集自癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)(http:/cancergenome nih gov)下载 164 例样本数据,其中包含 159 例级胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)组织样本和 5 例正常脑组织样本。自中国脑胶质瘤基因图谱数据库
16、(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)(www cgga org)下载 262 例胶质瘤患者样本,其中包含世界卫生组织(WHO)级 96 例,级 52 例,级 114 例。样本数据用于正常脑组织和胶质瘤组织中 Linc00645 表达情况的分析。1 2生存分析方法从 TCGA 和 CGGA 数据库中下载 GBM 患者的生存期数据,对 Linc00645 和 GBM患者生存期进行相关性分析,通过 Graphpad 软件采用 Kaplan-Meier 法绘制患者生存期曲线,并进行 Log-rank 检验,以 P 005 认为差异具有统计学意义。1 3与 Linc006
17、45 相关的功能分析使用基因本体论(gene ontology,GO)分析对 Linc00645 的生物学功能 进 行 预 测。通 过 Starbase V2 0 数 据 库 对Linc00645 进行靶基因预测并根据相关性选取前 50个基因作为靶基因,后通过功能注释生物信息数据库(The Database for Annotation,Visualization andIntegrated Discovery,DAVID)(https:/david ncifcrfgov/)对 Linc00645 进行基因功能注释,探索与Linc00645 相关性最高的生物学功能注释,收集差异倍数为 Fold
18、 change 2 且错误发现率 False discoveryrate 0 01 为有意义注释。1 4主要材料和试剂所有细胞株均采用含 10%胎牛血清、0 2%双抗(50 U/mL 青霉素和链霉素)的 DMEM 高糖培养基培养,细胞均培养在 37、CO2浓度为 5%的培养箱中。胎牛血清和 DMEM高糖培养基均购自美国 Hyclone 公司,青霉素-链霉素溶液(100 )购自上海碧云天生物技术有限公司。RNA 提取试剂盒,逆转录试剂盒和实时定量 PCR 试剂盒均购自瑞士 Roche 公司。Transwell小室(预铺基质胶)购自美国 Corning 公司。苏木素-伊红试剂盒和 MTT 细胞增殖
19、检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。载 Linc00645的 siRNA 所用商品化质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司。741临床神经外科杂志 2023 年第 20 卷第 2 期1 5实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)方法按照Trizol 说明书提取胶质瘤细胞系中的总 RNA,应用NanoDrop 检测 RNA 浓度。Linc00645 的正向引物序列为5-CAGAGGTGGTGCCTTGACA-3,反向引物序列为 5-ATATCCTCTGTGGCCCATGC-3,GAPDH作 为 内 参 基 因,其 正 向 引 物 序 列 为 5-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3,
20、反向引物序列为5-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3。以总 RNA 为模板,逆转录得到 cDNA,然后加入引物使用 SYBRGreen qPCR 分析法进行 qRT-PCR 实验,反应结束后使用 ABI Prism7900HT PCR 仪自带分析软件,导入原始数据,获得相应的 CT 值、Ct 值,并以 2 Ct值(Ct:循环阈值)算法分析 qRT-PCR 结果,得到目的基因的相对表达量。1 6细胞培养方法所有细胞株均采用含 10%胎牛血清、0 2%双抗(50 U/mL 青霉素和链霉素)的DMEM 高糖培养基培养。细胞均培养在 37、CO2浓度为 5%的培养箱中。在光学显微镜下观察并记
21、录细胞贴壁情况,2 3 d 更换完全培养基一次,换液时弃掉培养皿中培养基,加入预染的 PBS 液(pH=7 4)3 mL 漂洗 1 次,随后加入 5 mL 预热完全培养基,于培养箱中继续培养。1 7实验分组结果 1 分组:(1)正常组和 GBM组(图 1A);(2)级组,级组和级组(图1B);(3)人正常星形胶质细胞株(NHA)组和胶质瘤细胞株(U251、LN229、T98G、A172、SHG44)组(图1C)。结果 2 分组:(1)TCGA 中 Linc00645 低表达组(n=78)和高表达组(n=81)(图 2A);(2)CGGA中 Linc00645 低表达组(n=121)和高表达组(
22、n=141)(图 2B)。结果 3 分组:(1)U251 细胞株和T98G 细胞株中 si-NC 组和 si-Linc 1#组、si-Linc 2#组、si-Linc 3#组(图 3A);(2)U251 细胞株中 si-NC组和 si-Linc00645 组(图3B);(3)T98G 细胞株中 si-NC 组和 si-Linc00645 组(图 3C)。结果 4 分组:(1)U251细胞株中 si-NC 组和 si-Linc00645 组(图4A,4C-4E);(2)T98G 细胞株中 si-NC 组和 si-Linc00645组(图4B-4E)。结果 5 分组:(1)U251 细胞株中 si
23、-NC 组和 si-Linc00645 组(图 5E,5F);(2)T98G 细胞株中 si-NC 组和 si-Linc00645 组(图5E,5G)。1 8细胞转染转染前一天,将 5 105贴壁细胞铺到 6 孔板中。当细胞融合度达到 60%70%时用于进行后续实验。准备无 RNase EP 管,将 EP 管A:Opti-MEM 培养基 250 L+目的基因质粒 4 L(100 pmol)和 B:Opti-MEM 培 养 基 250 L+Lipofectamine 2000 5 L 混合后静置 20 min,加入 6孔板中培养 4 h。更换新鲜培养基继续培养 24 48 h后收集细胞。1 9细
24、胞增殖实验利用北京碧云天公司生产的MTT 细胞增殖检测试剂盒进行细胞增殖实验。根据说明书,在 15 mL 离心管中使用 5 mL 的 MTT 溶剂混匀溶解 25 mg MTT 粉,分装后置于 20 避光保存。将2 103/孔贴壁细胞铺到加入了100 L 培养基的 96 孔板中培养过夜。每孔加入 10 L MTT溶液后继续孵育4 h。每孔加入100 L Formazan 溶解液,轻轻混匀后继续孵育10 min,在光学显微镜下观察结晶紫的溶解程度。取出培养板后,使用酶标仪检测 570 nm 处的吸光度,导出数据,根据存活率计算公式得到相应数值,绘制增殖曲线。1 10细胞划痕实验细胞划痕实验是用来检
25、测细胞迁移运动和修复能力的方法。实验前所有工具进行高压灭菌,直尺和信号笔置于超净台中紫外照射 30 min。使用信号笔在无菌 6 孔板背后每隔0 5 cm 画一条横穿过孔直线。实验前一天加入5 105细胞铺板,培养过夜。实验时用枪头沿着直尺划过细胞方向与孔板背面画线相垂直,枪头垂直划过贴壁细胞。使用 PBS 液洗掉脱落的细胞,加入无血清培养基继续培养,在 0 h、24 h 取样拍照。使用 Image J 软件分析细胞修复面积,进行统计学分析。1 11Transwell 侵袭实验利用美国 Corning 公司生产的商品化的预包被基质胶 Transwell 小室进行Transwell 侵袭实验。使
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