植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制.pdf
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1、动物营养学报,():植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制张腾龙 郭晨阳 宋 洁 敖长金 王丽芳(内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特;内蒙古农牧业科学院,呼和浩特)摘 要:本试验旨在研究植物提取物复合制剂对脂多糖()诱导的奶牛乳腺上皮细胞()炎症模型免疫、抗氧化功能和转录组的影响,以揭示植物提取物复合制剂缓解 炎症反应的分子机制。试验选用第 代贴壁生长,随机分为 组,每组 个重复,每个重复 个培养孔。对照组 不添加 和植物提取物复合制剂,采用基础培养基培养 ;组 添加 作用 后,采用基础培养基培养 ;试验组 加入 作 用 后,分 别 加 入 (组)、(组)及 (组)的植物提
2、取物复合制剂,采用基础培养基培养 。测定各组免疫及抗氧化相关指标,并选择 组和 组进行转录组测序及分析。结果表明:)组 相对增殖率显著低于对照组(),组 相对增殖率显著高于 组(),且 组、组和 组 中肿瘤坏死因子()、白细胞介素()、白细胞介素()及白细胞介素()含量显著低于 组()。)组 中丙二醛()含量和诱导性一氧化氮合酶()活性显著高于对照组(),组、组和 组 中 含量和 活性显著低于 组(),组 中总超氧化物歧化酶()、过氧化氢酶()和谷胱甘肽过氧化物酶()活性及总抗氧化能力()显著高于 组()。)转录组测序结果表明,共有 个差异表达基因。富集分析显示,差异表达基因主要参与调节白细胞
3、介素()生成、白细胞介导的细胞毒素作用、细胞增殖等生物学过程。富集分析显示,差异表达基因主要集中在以 样受体()信号通路和 信号通路为主的免疫相关信号通路。)以介数中心性为指标进行网络分析,发现 样受体()、趋化因子()和集落刺激因子()等 个基因在植物提取物复合制剂调控的差异表达免疫基因中起到关键连接性作用。由此可见,植物提取物复合制剂可以提高 抗氧化功能,缓解 炎症反应,其分子机制是植物提取物复合制剂通过调节 信号通路和 信号通路缓解 的炎症反应,、和 等 个基因在差异表达免疫基因中起到关键性的连接作用。关键词:植物提取物复合制剂;奶牛乳腺上皮细胞;炎症反应;转录组中图分类号:文献标识码:
4、文章编号:()收稿日期:基金项目:国 家 自 然 科 学 基 金 项 目();内 蒙 古 自 治 区 科 技 计 划 项 目();内 蒙 古 自 然 科 学 基 金 项 目();内蒙古农牧业创新基金项目();奶牛疾病绿色防控技术应用示范()作者简介:张腾龙(),男,内蒙古呼和浩特人,博士研究生,动物营养与饲料科学专业。:通信作者:敖长金,教授,博士生导师,:;王丽芳,研究员,:动 物 营 养 学 报 卷 乳房炎是世界范围内奶牛养殖业中成本最高的疾病之一,其本质是乳房内部被细菌感染并产生炎症反应。尽管有许多细菌会引起乳房炎,但只有少数细菌是普遍存在于奶牛养殖场中。其中,革兰氏阴性菌大肠杆菌不仅是
5、广泛存在于环境中的致病菌,并且是在泌乳早期临床乳房炎奶牛中发现的最普遍的病原体,同时在日常养殖过程中很容易传播于牛群中,最终导致慢性或终身疾病。奶牛乳腺上皮细胞()是抵御乳房感染的第 道防线,细菌的毒素、酶和细胞壁成分对 的功能有直接影响,产生细胞因子等各种炎症介质。脂多糖()是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,能够刺激 产生白细胞介素()、白细胞介素()、白细胞介素()和肿瘤坏死因子()等促炎性细胞因子,从而诱发乳房炎,是目前国际上公认的研究奶牛乳房炎的主要病理模型。使用抗生素进行奶牛乳房炎的防治是牧场生产中最普遍的方法,但是由此导致的病原体耐药性和乳中抗生素的残留问题也越来越严重。有研究表明,
6、植物提取物可以治疗奶牛乳房炎,且具有长期使用不会诱发耐药性的优势,已成为最具应用潜力的抗生素替代品。等研究发现,槐蓝属植物中提取的靛玉红能够通过抑制 样 受 体 ()和 下 游 核 转 录 因 子 ()及丝裂原活化蛋白激酶()途径的炎症信号,改善由 诱导的小鼠乳房炎。等研究发现,蒲公英水提取物能够抑制 刺激的 牛 外 周 血 单 核 细 胞 中、和 等促炎性细胞因子的基因表达量,并抑制一氧化氮()的产生。金银花具有抗炎解热、抗衰老、抗氧化等生物功能;蒲公英有广谱抗菌作用;连翘能够抑制大肠杆菌、葡萄球菌及链球菌等病原微生物的生长;益 母 草 具 有 提 高 动 物 繁 殖 性 能 的 作用。因此
7、,本试验选择金银花、蒲公英、连翘和益母草的粗提取物制成植物提取物复合制剂,作用于 诱导的,研究其对炎症 的影响和机理,为植物提取物复合制剂在乳房炎奶牛上的应用提供数据支持。材料与方法 的培养 在奶牛屠宰后采集整个乳腺并迅速转移至实验室进行后续试验操作。使用无菌手术剪、手术刀及镊子进行样品的采集。将采集的乳腺组织分割为约 的组织块,要求腺泡丰富、导管和脂肪较少。每次使用约 个乳腺组织块进行后续试验。将采集的乳腺组织用无菌磷酸盐缓冲液()(双抗浓度为 )冲洗至无明显乳汁溢出,然后放入含 酒精的烧杯内清洗约,再依次在无菌(双抗浓度为 )中清洗 次。使用无菌眼科剪去除酒精浸泡过的外层组织、脂肪、结缔组
8、织和残留管腔结构。将符合上述要求的乳腺组织剪碎为直径 的颗粒并移入 刻度离心管内,向离心管内加入等体积 的型胶原酶溶液,置于 、饱和的培养箱中,消化 得到组织细胞混合液。将消化 的组织细胞混合液用 目孔径的无菌尼龙滤网过滤,将细胞滤液转移至 锥底刻度离心管中,于 离心,弃去上清液。然后向离心管内加入生长培养基悬浮细胞,将细胞和生长培养基的混合液接种于 一次性细胞培养瓶中,于 、饱和的培养箱中进行培养。待原代细胞生长且贴壁率达到 时,进行细胞纯化及传代。将分离纯化后的 鉴定后,连续培养到第 代,将其分别接种于试验设计要求的细胞培养器皿中,加入完全培养基,、条件下培养,待细胞贴壁率达到 时,弃去旧
9、培养基,加入不含胎牛血清培养基培养 后,按试验设计进行后续试验。试验设计 植物提取物复合制剂添加量的筛选 植物提取物复合制剂为金银花、益母草、连翘、蒲公英的植物水提取物按照干物质重量比 混合制成,各植物提取物委托南京泽朗生物科技有限公司进行制备,提取工艺条件为:倍水,提取 ,然后 倍水,提取 。种植物提取物的活性成分含量见表,委托武汉迈特维尔生物科技有限公司采用广泛靶向代谢组学方法进行测定。期张腾龙等:植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制表 种植物提取物的活性成分含量 项目金银花连翘蒲公英益母草黄酮 酚酸 核苷酸 有机酸 脂质 木质素和香豆素 其他 合计 将贴壁生长的第 代
10、 随机分为 组,每组 个重复,每个重复 个培养孔。对照组采用基础培养基,不添加植物提取物复合制剂,不同水平植物提取物复合制剂添加量分别为、和 ,培养时间为、和,以确定植物提取物复合制剂的适宜添加量。植物提取物复合制剂对炎症 的抑制作用 (,苯酚纯化,货号:)购自美国 公司。以 诱导 炎症损伤,建立炎症损伤模型,作用时间及作用浓度为课题组前期试验结果确定(添加剂量:,作用时间:)。将贴壁生长的第 代 随机分为 组,每组 个重复,每个重复 个培养孔。对照组(组)采用基础培养基,不添加 和植物 提 取 物 复 合 制 剂,培 养 ;组 加 入 的 作用 后,采用基础培养基培养 ;植物提取物复合制剂组
11、在加入 的 培养 后,再分别加入 (组)、(组)和 (组)的植物提取物复合制剂,采用基础培养基培养。测定指标与方法 相对增殖率 的相对增殖率采用 法测定。将第 代 悬液接种于 孔板中,按试验设计培养后,向各培养孔中加入 的 溶液,培养 后,使用全自动酶标仪检测各孔 吸光值(),相对增殖率计算公式如下:相对增殖率()(试验组 对照组 )。炎症因子及抗氧化指标 将试验中的细胞培养液收集于 管中,离心 ,收集上清液用于炎症 因 子 及 抗 氧 化 指 标 的 测 定。一 氧 化 氮()含量采用 法测定,试剂盒购自美国 公司。诱导性一氧化氮合酶()、总超氧化物歧化酶()、过氧化氢酶()活 性 和 总
12、抗 氧 化 能 力()及、白细胞介素()含量均采用酶联免疫吸附法测定。谷胱甘肽过氧化物酶()活性采用二硫代二硝基甲苯酸法测定。丙二醛()含量采用硫代巴比妥酸法测定。上述指标所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。转录组测序 细胞培养液收集完成后,用预冷的 溶液清洗 次细胞,加入胰蛋白酶消化细胞至部分细胞呈球状,用培养基终止消化后,加入 吹打,悬浮细胞,离心,弃去上清液,加入细胞保存液,保存,选择 组和 组委托上海美吉生物医药科技有限公司进行 的提取和测序。采用(公司,美国)法提取 中的总,并使用 (公司,日本)去除基因组。分别采用 (公 司,美 国)、(公司,美国)检测 样品的质量,以保证使用
13、合格的样品进行转录组测序。动 物 营 养 学 报 卷 文库的建立采用 试剂盒(公司,美国)。首先利用带有()的磁珠从 总 中富集有 尾的。再加入,将 随机断裂成 左右的小片段。接着采用 试剂盒(公司,美国),加入六碱基随机引物(公司,美国),以 为模板反转合成一链,随后进行二链合成,形成稳定的双链结构。双链的结构为黏性末端,加入 将其补成平末端,随后在 末端加上 个 碱基,用于连 接 字 形 的 接 头。经 过 富 集(试剂盒中自带)后,筛选 的条带。使用 荧光染料(公司,美国)经 微型荧光计定量后,文库使用 测序平台进行高通量测序,测序读长为双端测序(,)。数据处理与分析 试验数据采用 进行
14、整理分析,并使用 统计制图软件进行标准曲线的绘制,使用 统计软件中的 程序进行单因素方差分析。表示差异显著,表示差异不显著。委托上海美吉生物医药科技有限公司通过 平台进行高通量测序。应用 软件进行差异表达基因的筛选,多重验证采用()方法,显著性水平设置为校正后的 值(),差异倍数(,)设置为 以上。得到差异表达基因后对差异表达基因做 功能分析和 信号通路分析。使用 数据库搜索已知和预测的蛋白质相互作用的基因产物,置信评分临界值设置为。利用 软件进行互作网络图的绘制,从主网络集群中分离出的单节点、双节点和三节点被移除,并进行网络分析。节点颜色和大小分别基于差异基因表达量的上调、下调和介数中心性(
15、,)。结 果 植 物 提 取 物 复 合 制 剂 对 相 对增殖率的影响 从表 可以看出,当植物提取物复合制剂的添加量大于 时,会对 造成损伤;当培养时间超过 时,大部分添加量的植物提取物复合制剂会对 造成损伤。因此,根据相对增殖率最大值可以得出,植物提取物复合制剂的适宜添加量为 ,适宜培养时间为 。表 植物提取物复合制剂对 相对增殖率的影响 时间 植物提取物复合制剂添加量 ()植物提取物复合制剂对 诱导损伤的 相对增殖率、抗氧化和炎症因子指标的影响从 表 可 以 看 出,与 对 照 组 相 比,组 相对增殖率显著降低();中炎症因子指标、和 含量显著上升();中抗氧化指标、活性和 显 著 下
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