新疆帕米尔牦牛群体线粒体D...的遗传多样性及系统进化分析_高勤学.pdf
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1、第4 4卷 第7期家畜生态学报V o l.4 4N o.72 0 2 3年7月A c t aE c o l o g i a eA n i m a l i sD o m a s t i c iJ u l.2 0 2 3科学研究新疆帕米尔牦牛群体线粒体D NA的遗传多样性及系统进化分析 收稿日期 2 0 2 1-0 4-1 3修改日期:2 0 2 1-0 6-2 1 基金项目 江苏农牧科技职业学院凤凰人才计划项目(2 0 1 3 XWD-S 0 7 1 0 0 7)作者简介 高勤学(1 9 7 6-),男,安徽凤台人,博士,副教授,主要从事动物遗传育种研究。E-m a i l:3 0 8 3 1
2、3 4q q.c o m高勤学1,2,杨文科2,3,蒙永刚2,牙生江纳斯尔2,买买提吐尔干库瓦西2(1.江苏农牧科技职业学院 动物科技学院,江苏 泰州2 2 5 3 0 0;2.克孜勒苏柯尔克孜自治州畜牧兽医局,新疆 阿图什8 4 5 3 5 0;3.克孜勒苏柯尔克孜自治州畜禽繁育改良站,新疆 阿图什8 4 5 3 5 0)摘 要 为了从分子水平上探究新疆帕米尔牦牛群体的遗传多样性、亲缘关系,为帕米尔牦牛种质资源的保护与利用提供参考依据,该研究以克孜勒陶牦牛、布伦口牦牛、吉根牦牛、哈拉峻牦牛、库兰萨日克牦牛、苏木塔什牦牛等6个帕米尔牦牛类群的1 1 1头牦牛为研究对象,测定牦牛m t D NA
3、D-l o o p区序列,分析其多态性,构建系统进化树。结果表明:帕米尔牦牛m t D-N AD-l o o p区序列长度为8 9 5 9 1 6b p,共检测到1 1 1个变异位点,其中单态突变位点3 6个,简约信息位点7 5个;在1 1 1头个体中共检测出3 3种单倍型,平均单倍型多样性(Hd)、平均核苷酸多样性(Pi)分别为0.9 2 0 6、0.0 2 6 1 3;6个类群间平均遗传距离为0.0 2 7,哈拉峻牦牛与克孜勒陶牦牛间遗传距离最小(0.0 1 9)。以上结果表明,帕米尔牦牛具有丰富的遗传多样性,苏木塔什牦牛、哈拉峻牦牛是较纯的牦牛类群,其它牦牛类群在进化过程中出现相互交流的
4、情况。关键词 帕米尔牦牛;m t D NA;D-l o o p区;遗传多样性;系统进化树 中图分类号 S 8 2 3.8+5 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 5-5 2 2 8(2 0 2 3)0 7-0 0 0 9-0 7d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 3-1 1 8 2.2 0 2 3.0 7.0 0 2 现代牦牛(B o sg r u n n i e n s)是由野牦牛进化而来1,中国大约有1 41 06头牦牛,其中大部分饲养在高海拔的青藏高原,且已有约45 0 0年的驯化历史2,通过帕米尔地区向周边地区迁徙,从而形成了今天的牦牛分布状态。新疆有
5、牦牛2 61 04头左右,其中一半在巴音郭楞蒙古自治州(巴州),一半在克孜勒苏柯尔克孜自治州(克州)3。新疆巴州牦牛是2 0世纪2 0年代从西藏引入,经过近百年繁育逐渐形成的品种4;而克孜勒苏柯尔克孜自治州、喀什塔什库尔地区及阿克苏地区的牦牛属于比较古老的品种,均分布于帕米尔高原地区。此外,帕米尔地区还包括吉尔吉斯斯坦的巴达-赫尚省及塔吉克斯坦部分地区,因此本文将帕米尔地区的牦牛统称为“帕米尔牦牛”。线粒体D NA(m i t o c h o n d r i a lD NA,m t D NA)是存在于细胞质中的遗传物质,具有分子结构简单、突变率高、变异速度快等特点5,常被用于研究群体遗传结构、
6、遗传多样性以及种群间遗传关系等6。m t D NAD-l o o p区是线粒体上进化最快的区域且富有多态性,常用作分子标记7-8。因此,分析新疆帕米尔牦牛类群的m t D NA D-l o o p区序列多样性,将有助于研究该群体的亲缘关系及驯化过程,对于该物种遗传资源的保护和开发至关重要。李静等9对喀喇昆仑-帕米尔地区牦牛遗传多样性分析发现,喀喇昆仑-帕米尔地区牦牛拥有2个不同的母系起源,具有较独特的遗传背景,推测可能是由早期野牦牛驯化而来。虽然前人对新疆地区牦牛m t D NAD-l o o p区序列的遗传多样性进行了研究,也对帕米尔地区的牦牛遗传背景进行了探讨,但是没有对帕米尔牦牛多个群体
7、进行系统分析,针对帕米尔牦牛群体m t D-NAD-l o o p区的比较也尚未见报道。本研究旨在对新疆维吾尔族自治区克孜勒苏柯尔克孜自治州6个牦牛类群的m t D NA D-l o o p区序列进行测定,分析其遗传多样性和系统进化关系,以期全面而系统地评估新疆帕米尔牦牛的亲缘关系和遗传结构,为进一步保护和开发新疆帕米尔牦牛宝贵的遗传资源提供科学依据。1 材料与方法1.1 样品采集和基因组D NA提取2 0 1 5年4月从克孜勒苏柯尔克孜自治州的6个牦牛类群中选取健康的成年牦牛2 1 9头(表1),采用E D T A抗凝管静脉采集新鲜血样5m L置于4冰盒带回实验室,于-2 0保存备用。使用血
8、液基因组D NA提取试剂盒(无锡百运纳米科技有限公司)提取各类群牦牛血液的基因组D NA。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测D NA的纯度后,于-2 0 保存备用。表1 牦牛采样信息T a b l e1 S a m p l e i n f o r m a t i o no fB o sm u t u s类群P o p u l a t i o n缩写名称A b b r e v i-a t i o n s数量/头N u m b e r采样地点S a m p l i n gl o c a t i o n克孜勒陶牦牛K i z i l t oy a kK Z L T3 3阿克陶县布伦口牦牛B u l u n
9、g k o l y a kB L K3 0阿克陶县吉根牦牛J i g i ny a kJ G3 3乌恰县哈拉峻牦牛H a r a j u ny a kHL J4 7阿图什市库兰萨日克牦牛K u r a n s a r i ky a kK L S R K3 8阿合奇县苏木塔什牦牛S u m u t a s hy a kS MT S3 8阿合奇县1.2 P C R扩增和基因测序参考张成福等3对牦牛m t D NAD-l o o p区设计的 引 物,其 中F:5-C T A C AG T C T C A C C G T-C AA C C-3(L 1 5 7 3 7),R:5 -G G G G T G
10、 T AGAT G C T-T G C-3(H 4 9 6)。在引物(L 1 5 7 3 7)5 端加上M 1 3 F引物G T AAAA C GA C G G C C AG,在引物(H 4 9 6)5 端加 上M 1 3 R引 物C AG GAAA C AG C T AT GA C。融合引物由英维捷基(上海)贸易有限公司合成。P C R反应体系为2 5L,其中D N A模板2.5L(1 0 0n g/L),上下游引物各1L(1 0p m o l/L),2Q u i c kT a qH SD y e M i x预混合酶1 2.5L(上海东洋纺生物科技有限公司),灭菌d d H2O8L。P C
11、R反应条件:9 5预变性5m i n;9 5变性4 5s,5 8退火3 5s,7 2延伸1m i n,共8个循环;9 5变性4 5s,6 8退火延伸9 5s,2 7个循环;7 2延伸7m i n,8保存。P C R扩增利用A B Is y s t e m的V e r i t iV e r i t iR9 6-W e l lF a s tT h e r m a lC y c l e rP C R仪。P C R扩增后,取2L产物在1%的琼脂糖凝胶电泳验证,使用凝胶回收试剂盒(无锡百运纳米科技有限公司)进行纯化、回收后送往上海立菲生物技术有限公司进行正、反双向测序(7 3 0 X L型D NA测序仪
12、),测序引物分别采用M 1 3 F、M 1 3 R以及单独设计的引物(部分样品用通用引物未测出)。1.3 数据处理与分析试验数据用E x c e l 2 0 0 7和S P S S1 8.0进行统计分析,结果用“平均值标准差”(xs)表示。用G e n e i o u s(M a c8.0)软件进行生物信息学分析处理;用A l i g n/A s s e m b l e模块对所测序列进行拼接、人工校正等处理得到完整的m t D NAD-l o o p区序列;所得 序 列 采 用C l u s t a l W-A l i g n m e n t模 块 进 行 比对1 0。用ME GA6.0软件1
13、 1统计序列的碱基组成,计算类群间的K i m u r a双参数距离;D n a S P 4.0软件1 2进行多态位点(p o l y m o r p h i cs i t e)、单倍型数目(n u m b e ro fh a p l o t y p e,h)、单倍型多样性(h a p l o-t y p ed i v e r s i t y,Hd)和核苷酸多样性(n u c l e o t i d ed i-v e r s i t y,Pi)分析。同时在N C B I数据库下载牦牛线粒体D-l o o p片段2 9 5条,主要来自牦牛产区的青海、西 藏、新 疆(G e n e B a n k
14、登 录 号:D Q 1 3 8 9 9 8-D Q 1 3 9 2 6 0、AY 5 2 1 1 3 7-AY 5 2 1 1 6 1、D Q 0 0 7 2 1 0-D Q 0 0 7 2 1 4、AY 7 4 8 4 1 4-AY 7 2 2 1 1 8)。下载美洲野牛线粒体D-l o o p片段序列1条(G e n e B a n k登录号:U 1 2 9 3 6),C l u s t a l W-A l i g n m e n t模块进行序列对比,通过最大似然法构建进化树并计算遗传距离。2 结果与分析2.1 帕米尔牦牛线粒体D NA的遗传多样性帕米尔 牦 牛 基 因 组 经 扩 增 测
15、 序 后 拼 接 得 到m t D NAD-l o o p区序列长度为8 9 59 1 6b p,共得到1 1 1条有效序列,序列变异中有碱基的插入、缺失、替换,其中有3头牦牛的m t D NA D-l o o p区包含6b p的插入;检测到1 1 1个变异位点,其中单态突变位点3 6个,简约信息位点7 5个;胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)4种核苷酸的平均比例分别为2 8.8%(2 8.1%2 9.2%)、2 5.0%(2 2.8%2 6.3%)、3 2.5%(2 9.1%3 3.1%)、1 3.7%(1 3.0%1 5.8%),其中AT含量(6 1.3%)明显高于G
16、 C含量(3 8.7%),表明帕米尔牦牛m t D NAD-l o o p区序列富含A、T碱基,对A/T碱基具有一定的偏好性。对帕米尔地区6个牦牛类群的1 1 1头牦牛的遗传多样性进行统计分析,发现帕米尔牦牛m t D NAD-l o o p区共有3 3种 单 倍 型,平 均 单 倍 型 多 样 性(Hd)为0.9 2 10.0 1 3,平均核苷酸多样性(Pi)为0.0 2 6 1 30.0 0 2 2 2。各类群分别的单倍型数目、单倍型多样性和核苷酸多样性(Pi)见表2。帕米尔地区6个牦牛类群的单倍型多样性(Hd)变化范围在01家畜生态学报第4 4卷表2 帕米尔牦牛线粒体控制区序列遗传多样性
17、T a b l e2 G e n e t i cd i v e r s i t yo fm i t o c h o n d r i a lD NAc o n t r o l r e g i o ns e q u e n c e s i nP a m i ry a k类群P o p u l a t i o n样本数S a m p l es i z e单倍型数量h单倍型多样性Hd核苷酸多样性Pi克孜勒陶牦牛K i z i l t oy a k740.8 1 00.1 3 00.0 1 6 6 80.0 0 5 6 0布伦口牦牛B u l u n g k o l y a k1 91 10.8 6 0
18、0.0 7 10.0 2 1 9 80.0 0 4 2 3吉根牦牛J i g i ny a k1 370.7 9 50.1 0 90.0 2 9 6 90.0 1 1 5 4哈拉峻牦牛H a r a j u ny a k3 31 30.8 9 80.0 2 70.0 1 7 6 10.0 0 2 2 7库兰萨日克牦牛K u r a n s a r i ky a k881.0 0 00.0 6 30.0 1 5 6 20.0 0 6 5 1苏木塔什牦牛S u m u t a s hy a k3 11 50.9 1 80.0 3 40.0 3 0 4 70.0 0 6 4 60.7 9 51.0,
19、其中库兰萨日克牦牛的单倍型多样性(Hd)最高(1.0),吉根牦牛的单倍型多样性(Hd)最低(0.7 9 5);核苷酸多样性(Pi)变化范围在0.0 1 5 6 2 0.0 3 0 4 7,其中苏木塔什牦牛的核苷酸多样性(Pi)最高(0.0 3 0 4 7),库兰萨日克牦牛的核苷酸多样性(Pi)最低(0.0 0 1 5 6 2)。各类群单倍型数量及分布见表3。3 3种单倍型中有8种:H a p_1、H a p_3、H a p_5、H a p_9、H a p_1 0、H a p_1 5、H a p_1 7、H a p_2 0为共享单倍型,其它2 5个单倍型均为各类群所特有。2.2 帕米尔牦牛系统进
20、化分析利用ME GA5.2软件的邻接法(N e i g h b o r-j o i n-i n g,N J)对帕米尔牦牛的3 3种单倍型构建系统发育树。由图1可知,3 3种单倍型分为3个聚类簇(A、B、C),聚类簇A包含1 8种单倍型,占全部单倍型5 4.5 4%,涵盖本研究中所有的帕米尔牦牛类群;聚类 簇B中 有1 3种 单 倍 型,占 单 倍 型 总 数 的3 9.4%,同样涵盖本研究中所有的帕米尔牦牛类群;聚类簇C中有2种单倍型,占单倍型总数的6.0 6%,涵盖本研究中吉根牦牛和苏木塔什牦牛。帕米尔牦牛类群间的平均遗传距离为0.0 2 7(表4),其中哈拉峻牦牛与克孜勒陶牦牛间遗传距离最
21、小(0.0 1 9),库兰萨日克牦牛与吉根牦牛间遗传距离最大(0.0 3 6),但从整体来看,帕米尔牦牛群体间亲缘关系较近。此外,选取麦洼牦牛、九龙牦牛、西藏牦牛、天祝牦牛、新疆牦牛、犏牛、野牛等牛亚科代表性牛种及测序得到的塔什库尔干牦牛,共8个牛种,基于D-l o o p区序列计算牛亚种间遗传距离。如表5所示,不同牦牛类群间遗传距离来看,新疆牦牛与九龙牦牛和天祝牦牛遗传距离最近(0.0 1),帕米尔牦牛与新疆牦牛和天祝牦牛和九龙牦牛也较近(0.0 2),但帕米尔牦牛和新疆牦牛与西藏牦牛遗传距离都比较远(分别是0.0 3和0.0 4)。用最大似然法构建不同牦牛类群的系统发育树(图2),结果显示
22、这8个牛种主要有2个分支,其中第1个分支包含6 1头牦牛,主要有麦洼牦牛、九龙牦牛、天祝牦牛和西藏牦牛等类群,而第2个分支包含1 3 6头牦牛,涵盖本研究中的所有类群。表3 帕米尔牦牛的单倍型数量分布T a b l e3 H a p l o t y p e sd i s t r i b u t i o no fP a m i rY a k s单倍型种类H a p l o t y p e数量N u m b e r所含个体N u m b e r o f h a p l o t y p eH a p_12 1B L K(8)、H L J(7)、J G(2)、K Z L T(1)、S M T S(3)
23、H a p_21B L K(1)H a p_37B L K(3)、K L S R K(1)、J G(1)、S M T S(2)H a p_41B L K(1)H a p_54B L K(1)、H L B L K(1)、S M T S(2)H a p_62B L K(2)H a p_71B L K(1)H a p_81B L K(1)H a p_92B L K(1)、S M T S(1)H a p_1 01 6H L J(4)、H L B L K(2)、K Z L T(2)、S M T S(8)H a p_1 11K L S R K(1)H a p_1 21K L S R K(1)H a p_1
24、 31K L S R K(1)H a p_1 41K L S R K(1)H a p_1 51 3H L J(5)、J G(6)、S M T S(2)H a p_1 67H L J(7)H a p_1 76H L J(5)、J G(1)H a p_1 81H L J(1)H a p_1 92H L J(2)H a p_2 03H L J(1)、S M T S(2)H a p_2 11H L J(1)H a p_2 21J G(1)H a p_2 31J G(1)H a p_2 41J G(1)H a p_2 53K Z L T(3)H a p_2 61K Z L T(1)H a p_2 72S
25、 M T S(2)H a p_2 82S M T S(2)H a p_2 91S M T S(1)H a p_3 01S M T S(1)H a p_3 13S M T S(3)H a p_3 21S M T S(1)H a p_3 31S M T S(1)11第7期 高勤学,等:新疆帕米尔牦牛群体线粒体D NA的遗传多样性及系统进化分析图1 帕米尔牦牛的系统发育树F i g.1 N J t r e eo fP a m i ry a k s表4 帕米尔牦牛类群内的K i m u r a双参数遗传距离T a b l e4 K i m u r a2-p a r a m e t e rg e n e
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