基于脂质组学研究硒元素对妊娠期砷暴露大鼠脂代谢干预作用机制.pdf
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1、孕期雌鼠(GDO至GD20)经水暴露于质量浓度为0、0.1、1.0、10.0 mgL-的As3+中其中高剂量组于CD15-GD19时进行硒干预.GD20时取血液和肝脏,并计算肝脏系数.电感耦合等离子体质谱检测血清和肝脏中的元素含量;液相色谱串联三重四极杆质谱进行拟靶向脂质组学检测;全自动生化分析仪检测血清生化指标结果显示,高剂量砷暴露可诱发大鼠脂代谢紊乱,硒干预后会改变血清中脂质代谢过程。关键词:砷;硒;脂代谢;脂质组学中图分类号:R115文献标志码:AA Lipidomics-based Study on the Mechanism ofSelenium Intervention on Li
2、pid Metabolism inArsenic-exposed Rats During PregnancyZOU Xiaojie,HE Li,CAI Lijing,WANG Yan,ZHENG Nengxing,DING Rui3-4,WU Yan(1.School of Public Health,Fujian Medical University,Fuzhou 350122,China;2.School of Public Health,Xiamen University,Xiamen 361102,China;3.College of Environmental andResource
3、 Sciences/College of Carbon Neutral Modern Industry,Fujian Normal University,Fuzhou 350117,China;4.Fujian Key Laboratory of Pollution Control&Resource Reuse,Fuzhou 350117,China)Abstract:Pregnant female rats(GDO to GD20)were exposed to As3*in water at concentra-tions of 0,0.1,1.0,and 10.0 mg L-l.
4、The high-dose group underwent selenium intervention atGD15-GD19.Blood and liver samples were collected at GD20,and liver coefficients were calculat-ed.Inductively coupled plasma mass spectrometry was used to detect the elemental contents in serumand liver;liquid chromatography tandem triple quadrupo
5、le mass spectrometry was used for pseudo-targeted lipidomics;and a fully automated biochemical analyzer was used to detect serum biochemi-cal parameters.The results showed that high-dose As exposure induced disorders of lipid metabolismin rats,and Se intervention altered the process of lipid metabol
6、ism in serum.Key words:arsenic;selenium;lipid metabolism;lipidomics砷(arsenic,A s)是最普遍的环境毒素和致癌物,危害人类健康人类每天接触As的主要来源是食物和水,而它进人二者的方式主要包括自然来源、除草剂、木材防腐剂、燃料燃烧等 1-3。砷有两种与生物相关的氧化状态,即三价酸盐As()和五价砷酸盐As(V)【4 甲基化过程是人体砷代谢收稿日期:2 0 2 3-0 2-2 0基金项目:国家自然科学基金青年基金资助项目(2 2 0 0 6 0 16);福建省自然科学基金资助项目(2 0 2 2 J01710)通信作者:吴
7、衍(198 8 一),男,副教授,研究方向为环境卫生和代谢组学2023年20福建师范大学学报(自然科学版)的最重要过程,无机砷在甲基转移酶作用下以有机砷方式从体内消除 5,通常As(II)比 As(V)的毒性大得多 6 目前认为砷的毒性效应包括氧化胁迫和炎症反应。肝脏不仅是脂代谢和胰岛素作用的关键器官,也是砷代谢的主要靶器官孕期砷暴露不仅引起小鼠肝脏体质量比增加,而且肝脏中甘油三酯含量也显著升高 7 。甚至0.1mgL-1低剂量暴露下,子代血清中瘦素、胰岛素相比健康小鼠都显著升高,瘦素与肥胖和代谢综合征具有显著相关性 8 与非妊娠女性相比,孕期女性具有更高的无机砷甲基化效率 9-10 。塔溪矿
8、区“超基金”场地周边的流行病学调查首次发现,砷暴露可能增加孕妇葡萄糖耐量受损的风险并影响胎儿生长11-12 。法国人群的流行病学调查通过市政管网明确表明低水平砷暴露能够影响孕妇脂代谢稳态,证明孕期无机砷暴露风险易感性的存在 13-14.另一方面,硒(selenium,Se)元素作为必需元素通过肠道被人体吸收,而后产生的硒半胱氨酸为主的一系列硒蛋白是人体正常新陈代谢过程中不可或缺的;过量的硒可通过形成小分子代谢物排出体外,与砷相似,甲基化过程是人体代谢过量硒的重要环节 15 相关动物实验表明,小鼠补充硒能够改变脂肪酸代谢以及胆汁酸合成通路 16 高硒饮食暴露促进了猪肝脏中脂质合成和糖质新生,进而
9、抑制了脂质分解以及肝脏脂肪累积 17 此外,砷、硒会在豚鼠体内通过胆器官的代谢作用生成砷-硒结合体,进而促进砷在体内的代谢过程 18 在对砷污染区域孕妇的流行病学研究表明,孕妇尿液中的砷、硒代谢物呈显著正相关关系.甲基化是体内砷、硒代谢以及脂质代谢过程中共有的关键代谢节点,砷、硒暴露下甲基化相关脂质代谢稳态变化是两者健康效应的重要环节本研究从脂质组学角度出发,构造大鼠孕期饮水砷暴露模型,并于高剂量组设置硒干预,以探究硒在孕期砷暴露母体脂代谢过程中的作用,为临床孕妇补硒缓解环境暴露毒作用提供理论支持.1材料与方法1.1仪器与试剂1.1.1实验仪器G100智能控温电加热器,上海屹尧仪器科技发展有限
10、公司;MIDS-6G微波消解仪,上海新仪微波化学科技有限公司;ICP-MS7700电感耦合等离子体质谱,美国Agilent公司;液相色谱串联QTRAP-6500质谱,日本Shimadzu公司、美国ScientificExport公司;TBA-120FR全自动生化分析仪,日本Toshiba公司;TP-214分析天平,美国DenverInstrument公司;5415D小型高速离心机,5430 R高速冷冻台式离心机,德国Eppendorf公司.1.1.2实验试剂亚砷酸钠(分析纯),硒酸钠(分析纯),硝酸(体积分数6 8%,电子级),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇(HPLC级),乙腈(HPLC
11、级),异丙醇(LC级),四氢呋喃(HPLC级),德国Merck公司;甲酸(LC-MS级),美国ThermoFisher公司;氯仿(HPLC级),美国AnaquaChemicalsSupply公司;多元素标准溶液(CSB04-1767-2004,10 0 gmL-),国家有色金属及电子材料分析测试中心;SPLASH?LIPIDOMIX?质谱标准品,美国AvantiPolarLipids公司.1.1.3溶液配制亚酸钠溶液:准确称量17 3.4mg亚砷酸钠粉末溶解于10 mL超纯水中,配成质量浓度为17.34mgmL-的亚砷酸钠储备液,再用超纯水梯度稀释得到质量浓度为17.34、1.7 34、0.1
12、7 34mgL-的工作液.硒酸钠溶液:准确称量0.50 0 g硒酸钠粉末溶解于10 mL超纯水中,配成质量浓度为50mgmL-的硒酸钠储备液,再用超纯水梯度稀释为50 mgL的工作液.1.2实验方法1.2.1实验动物及暴露方法60只6 周龄SPF级Wistar大鼠(雌性50 只,雄性10 只)适应性饲养3周后,根据体质量(194.4理21邹晓杰,等:基于脂质组学究硒元素对妊娠期砷暴露干预作用机制刚第4期18.11)g 将50 只雌鼠随机分成5组,每组10 只,与雄鼠合笼后发现阴栓或阴道涂片可见大量精子,则定义为妊娠0 天(gestation day0,CD O)孕期雌鼠(CDO至CD20)经水
13、暴露于0、0.1、1.0、10.0mgL-As3*中,妊娠期间每天称量一次体质量.具体分组信息如下:对照组,饮用超纯水;低质量浓度(0.1mgL-)砷暴露组;中质量浓度(1.0 mg L-)砷暴露组;高质量浓度(10.0 mgL-)砷暴露组;高浓度砷暴露与硒干预组,在GD15-GD19时进行硒干预.本实验设定剂量依据:中国生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)规定饮用水中砷质量浓度最高为0.0 1mgL-119。研究显示,中国受污染地区地表水中的砷含量超过10 mgL-120。一名成年女性(50 kg),日饮水量为2 L,则每日砷暴露量为0.4gkg大鼠体内砷的代谢速度约为人的1010
14、0 倍 2 1】,则换算为孕鼠(195g,饮水量2 0 mL,50 倍代谢水平)的暴露剂量约为0.195mgL-1因此,本研究低剂量设置为0.1mgL-的砷暴露考虑到目前多地存在饮用水砷污染的情况,本研究设立中、高剂量组.中国营养学会推荐正常成年人硒的安全、合适的摄人范围为0.0 5 0.2 5mgd-l,可耐受最高摄人量为0.40 mgd=122-24。以0.1mgd-的人类硒摄入量为标准,以6.3为大鼠换算系数 2 5-2 6 ,根据孕鼠当日体质量进行硒酸钠溶液灌胃干预,1.2.2解剖与样本收集GD19晚间,对孕鼠禁食,GD20时称量孕鼠处死前的体质量采用心脏取血法采集右心房血液,静置2
15、h后于4、2 0 0 0 g离心10 min,随后分离血清;解剖肝脏组织,用生理盐水漂洗,滤纸吸干,称质量,计算肝脏系数,肝脏系数=(肝脏质量/体质量)10 0%.1.2.3样本前处理1.2.3.1元素分析称取肝脏样本2 0 0 mg、血清样本10 0 L,加4mL硝酸,3mL超纯水于微波消解仪进行消化处消化后冷却至室温,将样品定容至10 mL用于元素检测.1.2.3.2脂质组分析取30 L血清至玻璃试管内,同时加入3L脂质内标同步萃取依次向试管中加入6 0 0 L甲醇、10 0 0 L氯仿及50 0 L超纯水进行脂质提取,每次加人萃取剂后涡旋振荡15s,最后一次振荡后,将样品置于4静置2 h
16、.静置后,于4、40 0 0 rmin-1下离心10 min,收集下层澄清液体并转移至洁净干燥的玻璃试管中再次向原来的试管中加人6 0 0 L氯仿,涡旋振荡15s后于4静置1h.静置后,于4、40 0 0 rmin-1下离心10 min,收集下层澄清液体,与第一次样本合并利用N吹扫有机溶剂,保存样本于-8 0 上机前,用2 0 0 L复溶剂(V(乙腈):V(异丙醇):V(水)=6 5:30:5,包含5mmolL-1甲酸铵)复溶,涡旋15s,4、40 0 0 r minl离心10 min,取上清液50 uL.1.2.4元素含量检测取10 0 L质量浓度为10 0 gmL-的多元素标准溶液,用体积
17、分数5%的HNO,稀释10 倍,得到1mL10gmL-的标准储备液取0.5mL储备液,以10 倍的梯度逐级稀释2 次,得到50 mL100gL-1标准工作液逐级稀释该工作液,得到质量浓度为10 0.0、50.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5g L的标准溶液.用ICP-MS7700检测血清、肝脏中的元素含量仪器参数设置为:射频功率:1550 W;流速:等离子体气体,15Lmin;辅助气体,1Lmin;雾化气,1Lmin;补偿/稀释气体,1Lmin1分析元素质量数:镁(2 4Mg)、钒(5 V)、铬(52 Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(5Co)、镍(Ni)、铜(3Cu)、锌(6
18、Zn)、砷(7 5As)、硒(7 8 Se)、锶(8 Sr)、镉(Cd)、锡(18 Sn)、锑(12 1Sb)、钡(137 Ba)内标元素为(45Sc)、(10 3R h)、(17 5L u)、铋(2 0 9Bi).以混乱顺序排列样品,所有样品按照随机顺序进样,以减少在分析过程中因进样顺序和仪器灵敏度变化引起的不确定性为保证结果准确性,从每个样品中取出等量的小部分样品溶液,混合构成一个质量控制样品(qualitycontrol,Q C),每15个实际样品安排一次QC样品,每30 个进样程序(包含20233年福建师范大学学报(自然科学版)22QC)进行一次标准品回测,以评估仪器稳定性.QC样品与
19、标准品回测程序中,所有被测定元素的结果相对标准偏差小于15%,视为仪器稳定在基质空白溶液中,待测元素未检出.ICP-MS检测过程中内标元素响应值基本保持稳定,相对标准偏差小于5%.1.2.5血脂水平检测取10 0 L血清用TBA-120FR全自动生化分析仪检测血清中的胆固醇(cholesterol,CH)、甘油三酯(triglycerides,T G)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,H D L)、低密度脂蛋白(low-density lipo-protein,L D L)、总胆红素(total bilirubin,T BIL).1.2.6靶向脂质组学分析复溶后
20、的待测样品使用LC-MS/MS进行分析利用WatersCortecsC8液相色谱柱(2.1mm100mm,2.7 m)对脂质进行液相分离柱温为55,样品室温度为10,流速为0.39mLmin,进样量2 L.流动相A和B分别为:乙腈/水(体积比为6 0:40)和异丙醇/乙睛(体积比为90:10),二者均含10 mmolL-甲酸铵、体积分数0.1%甲酸.离子喷雾电压550 0 V,离子源温度50 0,离子源气体CS1和CS2均为50,碰撞气设定为6,气帘气为45,驻留时间设置为2 ms.2结果2.1砷暴露对大鼠体质量及肝脏系数的影响在大鼠孕期内,每天记录其体质量大鼠体质量增长系数和肝脏系数如图1所
21、示单因素方差分析(one-way analysis of variance,A NO VA)结果显示,与对照组相比,高剂量组大鼠体质量增长幅度和肝脏系数最大(P0.05),且与中、低暴露水平组间存在差异(表1)此外,与高剂量组大鼠相比,硒干预组的体质量和肝脏系数均显著降低,不同暴露水平组数据趋势一致(图1).表1不同剂量砷暴露对大鼠体质量变化系数及肝脏系数的影响(均数标准差)Tab.1Effects of different doses of arsenic exposure on body weight changecoefficient and liver coefficient in r
22、ats(meanSD)组别体质量变化系数/%肝脏系数/%对照38.456.072.650.08低剂量33.04 5.842.590.06中剂量32.864.422.61 0.07高剂量46.16 8.03a2.79 0.09b硒干预31.043.552.65 0.12注:a体质量变化系数P0.05;b 肝脏系数P0.05.*ab本0.60.030m*0.0290.40.0280.0270.20.0260.02500.024低剂量中剂量高剂量低剂量中剂量高剂量硒干预(a)体质量增长系数;(b)肝脏系数(*表示P0.05)图1大鼠体质量增长系数和肝脏系数小提琴图Fig.1Violin plots
23、of body weight gain coefficients and liver coefficients in rats变化23邹晓杰,等:基于脂质组学究硒元素对妊娠期砷暴露大鼠脂代谢干预作用机制第4期2.2砷暴露对大鼠血清、肝脏的代谢影响2.2.1砷暴露对大鼠血清、肝脏的元素分布的影响根据ICP-MS检测结果,采用ANOVA分析不同暴露剂量下元素的组间差异.其中血清和肝脏中仅有砷元素在组间差异具有显著性(P0.001,图2)这说明饮水砷暴露可引起血清和肝脏中砷的过度累积如图2 b所示,与高剂量组相比,硒干预组的大鼠肝脏中砷含量显著降低(P=0.002),暗示硒干预降低了砷在肝脏中的累积
24、.2.2.2砷暴露对大鼠脂代谢的影响为了进一步说明砷暴露对孕鼠脂质代谢的影响,采用生化分析仪分别对 CH、T G、H D L 及LDL4个脂质相关代谢标记物进行分析Spearman相关性分析显示,血清中砷浓度与CH、T G 呈正相关关系(r,=0.36 0,P=0.023;r,=0.399,P=0.011),与 LDL负相关(r,=-0.317,P=0.046)肝脏中硒则与 TG呈负相关(r,=-0.325,P=0.041),总胆红素(TBIL)也呈现出类似的结ab207*250*20015(-T.8)/d(-T.81)/d150101005500对照低剂量中剂量高剂量硒干预低剂量中剂量高剂量
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