基于铁死亡探讨褪黑素缓解布比卡因脊髓神经毒性的机制.pdf
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1、广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2023Jul.40(7)基于铁死亡探讨褪黑素缓解布比卡因脊髓神经毒性的机制*刘子儒,赵漾,陈园园,罗云鹏,罗茜,韦丽玲,周刚,刘敬臣(广西医科大学第一附属医院麻醉科,南宁530021)摘要目的:探讨褪黑素(MT)能否通过抑制铁死亡缓解布比卡因脊髓神经毒性。方法:将36只成年雄性SPF级SD大鼠随机分为3组:生理盐水组(N组)、布比卡因组(B组)、褪黑素与布比卡因共处理组(BM组),各组于0 d、1 d、2 d、3 d测定最大抗伤害效应百分比(%MPE)、BBB评分进行行为学评估,并于给药后3 d取材,取
2、腰膨大处脊髓组织进行HE、尼氏染色观察各组脊髓组织神经元病理损伤情况和神经元存活数量,透射电镜观察线粒体超微结构改变,多重免疫荧光检测活性氧(ROS)表达水平,ELISA检测谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、铁含量,western blotting检测脊髓组织GPX4、4HNE的蛋白表达水平。结果:与N组比较,B组%MPE升高,BBB评分降低,脊髓组织空泡增多,存活神经元数量减少,脊髓组织损伤程度较重,线粒体缩小,双层膜密度增加,线粒体嵴消失或断裂,ROS、MDA、铁含量增多,GSH降低,4HNE蛋白表达升高,GPX4蛋白表达降低(均P0.05)。与B组比较,BM组%MPE降低,BBB评分
3、升高,脊髓组织损伤较轻,脊髓组织空泡减少,存活神经元增多,线粒体损伤改善,ROS、MDA、铁含量下降,GSH升高,4HNE蛋白表达降低,GPX4蛋白表达升高(均P0.05)。结论:MT可抑制铁死亡,从而缓解大鼠鞘内注射布比卡因引起的脊髓神经毒性。关键词神经毒性;铁死亡;褪黑素;布比卡因中图分类号:R614.4文献标志码:A文章编号:1005-930X(2023)07-1085-07DOI:10.16190/ki.45-1211/r.2023.07.002Mechanism of melatonin attenuating bupivacaine-induced spinal cord neur
4、otoxicity based onferroptosisLiu Ziru,Zhao Yang,Chen Yuanyuan,Luo Yunpeng,Luo Xi,Wei Liling,Zhou Gang,Liu Jingchen.(DepartmentofAnesthesiology,The FirstAffiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)AbstractObjective:To explore whether melatonin(MT)could attenuate bupivacaine
5、-induced spinal cord neu-rotoxicity by inhibiting ferroptosis.Methods:36 adult male SPF SD rats were randomly divided into threegroups:normal saline group(N group),bupivacaine group(B group),and melatonin and bupivacaine co-treatedgroup(BM group).The maximum percentage of anti-injury effect(%MPE)and
6、 BBB score were determined onday 0,day 1,day 2 and day 3 of each group for behavioral evaluation and the samples were collected 3 days afteradministration.The spinal cord tissues at lumbar enlargements were taken for HE and Nissl staining to observethe pathological injury of neurons and the survival
7、 number of neurons in the spinal cord tissues of each group,and the mitochondrial ultrastructure change was observed by transmission electron microscopy.The expressionlevels of reactive oxygen species(ROS)were detected by multiple immunofluorescence,the levels of glutathione(GSH),malondialdehyde(MDA
8、)and iron were detected by ELISA,and the protein expression levels of GPX4and 4HNE in spinal cord were detected by western blotting.Results:Compared with the N group,MPE%in-creased,BBB score decreased,spinal cord tissue vacuoles increased,surviving neurons decreased,spinal cord tis-sue damage was mo
9、re severe,mitochondrial shrink-age occurred,double membrane density increased,mitochondrial ridge disappeared or was broken,ROS,MDA,and iron levels increased,GSH de-*基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.81660623);广西医科大学研究生创新项目(No.YCBZ2022091)通信作者,E-mail:收稿日期:2023-04-19基础研究 1085广西医科大学学报2023 Jul.40(7)creased,and the
10、protein expression of 4HNE increased while GPX4 protein expression decreased(all P0.05)inthe B group.In comparison with the B group,%MPE decreased,BBB score increased,spinal cord tissue damagewas alleviated,spinal cord tissue vacuoles were reduced,surviving neurons increased,mitochondrial damage was
11、improved,ROS,MDA,and iron levels decreased,GSH increased,and the protein expression of 4HNE decreasedwhile the protein expression of GPX4 increased(all P0.05)in the BM group.Conclusion:MT can inhibit fer-roptosis,thus attenuating the bupivacaine-induced spinal cord neurotoxicity.Keywordsneurotoxicit
12、y;ferroptosis;melatonin;bupivacaine局部麻醉药广泛应用于椎管内麻醉、神经阻滞及术后镇痛等临床操作中,以减轻患者围手术期疼痛。但即使在临床推荐浓度下,局部麻醉药仍可能引起神经毒性反应并导致神经损伤1。布比卡因是一种常用的局麻药,其可能导致椎管内神经并发症,如短暂性神经综合征(transient neurologic syn-drome,TNS)和马尾神经综合征(cauda equina syn-drome,CES),预后较差2。因此,探索局麻药神经毒性的机制及治疗药物对相关疾病具有重大意义。铁死亡是一种由氧化应激反应和活性氧(reac-tive oxygen s
13、pecies,ROS)积累驱动的细胞死亡的形式,近年来铁死亡被证明与急性中枢神经系统疾病密切相关3,而在布比卡因所致脊髓神经毒性中的作用尚未见报道。褪黑素(melatonin,MT)是一种常见的抗氧化剂,近年来被发现能够通过抑制铁死亡缓解缺氧缺血性脑损伤4。然而,铁死亡在布比卡因导致的脊髓神经毒性中的机制尚不清楚。因此,本研究拟探索铁死亡在布比卡因诱导脊髓神经毒性中的机制及MT能否通过抑制铁死亡缓解布比卡因所致的脊髓神经毒性,从而为治疗局麻药神经毒性寻找新的治疗靶点。1材料与方法1.1药物与主要试剂PE-10 导管购自史密斯医疗(Smith Medical)公司(英国);布比卡因(货号:B52
14、74)和 MT(货号:M5250)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;GPX4抗体购自Abmart医药科技(上海)有限公司,4HNE 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,GAPDH 抗体购自武汉 ABclonal 生物科技有限公司;RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、5蛋白上样缓冲液、BCA检测试剂盒、ROS探针购自武汉赛维尔生物科技有限公司。组织铁含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,谷胱甘肽(glutathione,GSH)测试盒,丙二醛(Malondialde-hyde,MDA)测试盒购自南京建成生物工程研究所。1.2实验动物36只SPF级成年健康雄性SD大鼠,体重2
15、50270 g,购于广东维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(粤)2022-0063。对大鼠进行分笼饲养,提供充足饮水及饲料,并在适宜温度下保持明暗12 h/12 h周期循环。本动物实验已获广西医科大学实验动物伦理委员会批准,审批号:202111014。1.3蛛网膜下腔置管采用PE-10导管、改良Yaksh法5对大鼠行L5L6椎间隙向头端鞘内置管。置管成功的大鼠固定导管后予以鞘内注射 2%利多卡因 10 L,注射后30 s内出现双下肢不能活动且感觉丧失,并于30 min内恢复者即为造模成功,否则予以剔除。成功造模的大鼠单笼饲养2 d后用于后续实验,期间出现后肢运动功能障
16、碍或感觉功能异常者予以剔除。1.4动物分组与给药将36只SD大鼠按照随机数字表法分为3组:生理盐水组(N组)、布比卡因组(B组)和褪黑素与布比卡因共处理组(BM组),每组12只。B组接受鞘内注射5%布比卡因,剂量为0.12 mL/kg,共进行3次,每次间隔1.5 h,注射后立即进行腹腔注射与BM组给予MT等体积的生理盐水,每天1次,连续3 d;BM组接受与B组相同的鞘内注射,注射后立即向腹腔注射剂量为12.5 mg/kg的MT,每天1次,连续3 d。N组接受鞘内注射生理盐水,剂量为0.12mL/kg,共3次,每次间隔1.5 h,然后腹腔注射生理盐水,注射量同B组。各组在给药后3 d取样。1.5
17、检测指标1.5.1 感觉功能及运动功能评价采用YI5-12A型鼠尾光照测痛仪于给药后0 d、1 d、2 d、3 d测定大鼠甩尾反应潜伏期,测量重复3次,每次间隔5 min,取平均值。将甩尾反应潜伏期(tail-flick latency,TFL)1086换算成最大抗伤害效应百分比(percentage of maxi-mum possible effect,%MPE)。为避免烫伤鼠尾,设定TFL最大值为16.01 s。%MPE=(实测值基础值)(最大值基础值)100%采用脊髓损伤行为学评分(basso,beattie,bres-nahan,BBB)量表于给药后0 d、1 d、2 d、3 d进行
18、行为评分,该量表以021分为范围评价大鼠后肢的不同活动情况,0分表示后肢无活动,21分表示后肢活动正常。1.5.2苏木精伊红(HE)染色和尼氏染色观察脊髓神经元损伤情况对大鼠进行全身麻醉后,自左心室注射4 生理盐水进行心脏灌注至大鼠肝脏发白,迅速取脊髓腰膨大组织并置于4%多聚甲醛中固定24 h,石蜡包埋,以4 m厚度连续切片后分别进行HE、尼氏染色。1.5.3 透射电镜观察线粒体超微结构采用4%多聚甲醛对大鼠进行全身灌注,小心取脊髓腰膨大处1 mm1 mm1 mm的组织置于4 电镜固定液过夜,次日1%锇酸固定后漂洗、脱水、包埋、切片,切片进行醋酸铀柠檬酸铅双重染色。切片干燥后在透射电子显微镜下
19、观察线粒体超微结构,采集图像分析。1.5.4冰冻切片免疫荧光检测ROS冰冻切片复温后,用组化笔在组织周围画圈,自发荧光淬灭剂浸泡,流水冲洗,滴加ROS染液,恒温箱37 避光孵育30 min后进行染色。洗涤后加含DAPI抗荧光淬灭封片剂封片。使用荧光显微镜观察拍照,蓝色荧光为细胞核染色,代表整片所有细胞数,红色荧光为ROS阳性表达。1.5.5 检测大鼠脊髓组织中GSH、MDA含量准确称取大鼠脊髓组织重量,按重量(mg)体积(L)=19的比例加入9倍体积的匀浆介质,冰水浴条件下,机械匀浆,制备成 10%的匀浆液,2 5003 000r/min,离心10 min,取上清液,根据试剂盒说明书步骤检测脊
20、髓中GSH、MDA含量。1.5.6检测大鼠脊髓腰膨大组织中铁含量称取约0.1 g大鼠脊髓腰膨大组织,加入1 mL提取液进行冰浴匀浆。4 000 r/min 4 离心10 min,取上清液,根据试剂盒说明书步骤检测脊髓组织中铁含量。1.5.7Western blotting法检测各组相关蛋白表达水平采用BCA法检测蛋白浓度,10%SDS-PAGE凝胶电泳使蛋白分离,湿法将蛋白转至 PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭 1 h;一抗:GPX4(11 000)、4HNE(11 000)以及内参蛋白GAPDH(15 000)4 恒温孵育;次日二抗HRP标记山羊抗兔/鼠(110 000)室温孵育。使用Ode
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