青海省辣椒隐症病毒1的鉴定与全基因组序列克隆.pdf
《青海省辣椒隐症病毒1的鉴定与全基因组序列克隆.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《青海省辣椒隐症病毒1的鉴定与全基因组序列克隆.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、【目的】明确青海省辣椒病毒病病原种类,获得乐都长辣椒的辣椒隐症病毒 1(Pepper cryptic virus 1,PCV1)分离物的全基因组序列。【方法】2021年6月对青海省辣椒病毒病进行调查并采集疑似病样,对采集的样品分别用通用引物和特异性引物进行RT-PCR检测,后续通过克隆的方法得到PCV1的全基因组序列,用NCBI进行序列比对后用MEGA6.0软件最大似然法(maximum likelihood)、自导复制(bootstrap)1 000次构建系统进化树,并运用同源性分析和聚类分析方法对PCV1的2条RNA链进行分析。【结果】采自乐都区的15份辣椒病样中,确认检出10份感染PCV
2、1,其RNA1和RNA2的全长分别为1 563 bp和1 495 bp。NCBI网站序列比对分析结果表明克隆得到的PCV1青海分离物序列与已报道的PCV1其他分离物的核苷酸序列一致性与氨基酸一致性高于95%。系统发育分析表明RNA1和RNA2分别与其他PCV1分离物聚在一支上,与其同属的辣椒隐症病毒2(pepper cryptic virus 2,PCV2)分离物聚在不同的分支上。【结论】青海省辣椒上检测得到的病毒为PCV1,并获其全基因组序列,对今后保护青海省当地特色辣椒品种资源、不同地区的PCV1基因组遗传方式等研究的相关工作奠定理论基础。关键词:辣椒;辣椒隐症病毒1;全基因组;青海省中图
3、分类号:S436.418.12 文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):文章编号:1003-4315(2023)03-0125-08Identification and whole genome sequence cloning of pepper cryptic virus-1 in Qinghai ProvinceYUAN Lei,LUO Hailin,YAN Jiahui,GUO Qingyun(Academy of Agricultural and Forestry Sciences of Qinghai University,Xining Crop Pest Scie
4、nce Observatory and Experiment Station,Ministry of Agriculture and Rural Areas,Xining 810016,China)Abstract:【Objective】The aim of this study was to identify the pathogenic species of pepper virus in Qinghai Province and obtain the whole genome sequence of pepper cryptic virus 1(PCV1)isolate from Led
5、u Long Pepper.【Method】Suspected disease samples of Capsicum were investigated in June 2021 in Qinghai Province.The samples were detected using RT-PCR with universal and specific primers.The whole genome sequence of PCV1 was obtained using the cloning method,and a phylogenetic tree was constructed us
6、ing MEGA6.0 software Maximum Likelihood and Bootstrap 1000 times after sequence comparison with NCBI.The two RNA strands of PCV1 were analyzed using homology and cluster analysis methDOI:10.13432/ki.jgsau.2023.03.016第一作者:袁雷,硕士研究生。E-mail:通信作者:闫佳会,副研究员,主要从事作物病害方向研究。E-mail:郭青云,研究员,主要从事植物保护方向。E-mail:基金项
7、目:青海省国际科技合作项目(2022-HZ-806)。收稿日期:2022-05-11;修回日期:2022-05-29甘肃农业大学学报2023 年ods.【Result】The results showed that of the 15 pepper disease samples collected from Ledu District,10 samples were confirmed to be infected with PCV1,and the total lengths of RNA1 and RNA2 were 1 563 bp and 1 495 bp,respectively.
8、the nucleotide sequence consistency and amino acid consistency between the cloned PCV1 Qinghai isolate and other reported PCV1 isolates were higher than 95%according to the NCBI website sequence comparison analysis.Phylogenetic analysis showed that RNA1 and RNA2 were clustered on one branch with the
9、 other PCV1 isolates,respectively,and the same genus of Pepper cryptic virus 2(PCV2)isolates were clustered on different branches.【Conclusion】The virus detected on pepper in Qinghai Province was identified as PCV1,and its whole genome sequence was obtained.This study lays a theoretical foundation fo
10、r future research on the protection of local pepper varieties and the genetic mode of PCV1 genome in different regions in Qinghai Province.Key words:pepper;pepper cryptic virus 1;whole genome;Qinghai Province青海省位于青藏高原东北部,辣椒(Capsicum annuum L.)1-2是当地受众度极高的特色蔬菜,风味独特广受欢迎,具有非常好的发展前景。因此,辣椒在青海省内被广泛种植,而乐都长
11、辣椒是其中的知名品种,具有皮薄肉厚、辣味适中、采收期整齐一致、耐贮存等特点。因其外形与猪大肠相似,又被称为“猪大肠”,成为当地地理标志产品3。因上述便于栽培、品质优良且市场认可度高等原因,乐都长辣椒成为了当地农民增收的主栽经济作物。近年来,随着辣椒种植面积持续增加,病毒病的发生也越发频繁。2017年,李廷芳等4在青海省海东市的设施辣椒上检测出辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV);吴淑华等5于2020年在青海省西宁市的设施辣椒上检测出番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)。辣椒病毒病发病周期短,流行速度快,危害逐年加
12、重,导致乐都长辣椒品种退化,出现褶皱消失和香辣味变淡等品质变劣的现象,并造成辣椒的产量降低,阻碍当地辣椒产业的发展6。辣椒隐症病毒1(pepper cryptic virus 1,PCV1)是1种重要的辣椒病毒,属于双分病毒科(Partitiviridae)丁型双分病毒属(Deltapartitivirus)的1个典型种1,7。继 1995 年 Arancibia 等8发现 PCV1 后,中国、北美及东亚等地陆续出现其侵染辣椒的报道。在我国,PCV1是近年来新出现的病毒,2019年刘勇等1在山东辣椒上检测出PCV1,同年,汤亚飞等9在广东辣椒上检测出PCV1。PCV1有2条dsRNA,分别编码
13、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)和外壳蛋白(coat protein,CP)10-12。目前没有已知的可以传播PCV1的自然媒介,该病毒不能通过摩擦接种传播,但可以通过种子、花粉(父系)和卵细胞(母系)进行传播13-15。乐都长辣椒作为青海省地理标志产品,在调研过程中发现部分辣椒无明显发病症状,但产量较低。为进一步明确造成该现象的原因,本研究采集了此类样品的辣椒叶片,并对其进行RT-PCR检测,结果显示部分样品受到PCV1的侵染。基于检测结果,本研究对PCV1基因组全序列进行了克隆与分析,以期为后续开展PCV1相关功能研究奠定基础。
14、1材料与方法1.1试验材料2021年6月,在青海省海东市乐都区采集无明显症状但产量较低的长辣椒叶片15份,用液氮进行低温速冻处理后放到超低温冰箱-80 保存备用。1.2辣椒病叶总RNA的提取取辣椒病叶0.1 g在液氮中速冻后放入组织破碎仪(Tissue Lyser)中打碎成粉末状。利用Trizol法提取辣椒病叶的总RNA16,将提出的总RNA用20 L 的 ddH2O 进行溶解,并用微量核酸测定仪(ND-one 2000 drop)对 RNA 进行质量检测,所提RNA的D260 nm/D280 nm在1.82.0之间,将RNA保存于-80 冰箱备用。1.3cDNA合成以提取的总RNA为模板,采
15、用Fastking一步法RT-PCR 试剂盒(天根生物科技有限公司)合成cDNA。反应体系为20 L:5xFastKing-RT SuperMix 4 L;总 RNA 2 L;RNase-Free H2O 14 L。反应程序:42 15 min,95 3 min。待反应完成后,126第 3 期袁雷等:青海省辣椒隐症病毒1的鉴定与全基因组序列克隆将cDNA放置于-20 冰箱保存备用。1.4PCV1病毒的RT-PCR检测根据现有报道的 PCV1 的特异性引物 PCV1dF/PCV1dR 17,以 1.3 中 cDNA为模板,进行 RT-PCR检测18。依次加入试剂:2TaqMix(天根生物科技有限
16、公司)10 L;上游引物1 L;下游引物1 L;cDNA 1 L;ddH2O 7 L。总体系20 L,反应程序为:94 5 min;94 45 s,60.8 45 s,72 30 s,34个循环;72 10 min;4 保存。反应完成后,取5 L的PCR产物,进行1%的琼脂糖凝胶电泳,完成后置于凝胶成像仪观察条带并拍照。1.5PCV1全基因组克隆PCV1的全基因组包含2条单链RNA,分别为RNA1和RNA2。根据辣椒隐症病毒1的基因组序列 设 计 特 异 性 引 物 PCV1RNA1-F/PCV1RNA1-R,PCV1RNA2-F/PCV1RNA2-R,并对 RNA1 和 RNA2 进行扩增和
17、克隆(表1),获得全基因组的序列。PCR的反应体系为25 L,其中:5PrimeSTAR HS Buffer(Mg2+Plus)(北京宝日医生物科技有限公司)5 L;上游引物 1 L;下游引物 1 L;dNTP 2 L;Prime STAR HS DNA polymerase(北京宝日医生物科技有限公司)0.25 L;目的条带所相对应的 cDNA 1 L;RNase-Free H2O 补足至25 L。反应程序为:94 1 min;98 10 s,Tm(退火温度根据上述引物设置)5 s,72 延伸(延伸时间为1 kb/min),34个循环;72 10 min。待反应程序完成后,对PCR的产物进行
18、琼脂糖凝胶电泳检测,获得目的片段,然后进行凝胶回收与纯化。将回收的产物用pEASY-Blunt载体进行连接,并转化到Trans-T1感受态细胞中(北京全式金生物技术有限公司),挑选3个阳性克隆送到杨凌天奥科技有限公司进行测序。1.6序列分析的方法测序所得到的结果经NCBI进行比对(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)后用 MEGA6.0软件最大似然法(Maximum Likelihood)、自导复制(Bootstrap)1 000次构建系统进化树。2结果与分析2.1辣椒病样RT-PCR检测对采集的样本提取总 RNA,经过反转录后用PCV1的特异性引物
19、PCV1dF/PCV1dR进行相应的RT-PCR检测,电泳结果显示15份样品中,有10份扩增得到大小约250 bp的条带,与目的条带245 bp大小非常接近(图1)。剩下的5个样品没有扩增到相应的条带。随机抽取3个已经扩增到目的条带的样品,对其进行凝胶回收与纯化,进行克隆转化试验,并送到公司测序,将测序得到的结果在NCBI网表1PCV1的检测和全基因组克隆特异性引物序列Table 1PCV1 detection and whole gename clone specific primer sequence引物PrimersPCV1dFPCV1dRPCV1RNA1-FPCV1RNA1-RPCV1
20、RNA2-FPCV1RNA2-R序列Sequence(5 3)ACATCATCGAGGAGTTCACCGCTGTCCTAGAATTGTCTTCAGAATTTCCCCCTTGTTCCAAGGTAAGGTTTAAATACCTTCCACGATGGGCGATCGTGTTAACGCTCTTAAGCAATGATAAACATTCTTAAAGCTGC退火温度/Tm59.057.861.3长度/bpLength2451 5631 495M:DL 2000 Marker;通道115:辣椒样本;CK:清水对照。M:DL 2000 Marker;Lane 115:pepper sample;CK:Water cont
21、ro.图1PCV1样本RT-PCR检测Figure 1PCV1 virus samples were detected by RT-PCR127甘肃农业大学学报2023 年站上比对,BLAST结果显示,其与PCV1的氨基酸、核苷酸一致性较高,均为90%100%。上述结果表明,在青海省海东市乐都区所采集的辣椒病毒病病样中,存在PCV1感染的现象。2.2辣椒病样中PCV1全基因组克隆基于克隆的方法,获得 PCV1全基因组序列。以采集的辣椒病样cDNA为模板,分别利用特异性引 物 PCV1RNA1-F/PCV1RNA1-R 和 PCV1RNA2-F/PCV1RNA2-R扩增 RNA1和 RNA2,获
22、得约 1 563 bp和1 495 bp的目的条带。将目的条带回收纯化,并把纯化后的目的片段连接到克隆载体pEASY-Blunt上,并转化至大肠杆菌Trans-T1。放置于光照培养箱,在37 的条件下暗培养8 h,挑选3个阳性克隆送至公司测序。将测序得到的结果用DNAMAN软件进行比对,以此获得了PCV1的全基因组序列,碱基序列如下(图2)。2.3PCV1全基因组结构分析运用DNAMAN软件对PCV1 RNA1和RNA2图2PCV1基因序列Figure 2Gene sequence of PCV1128第 3 期袁雷等:青海省辣椒隐症病毒1的鉴定与全基因组序列克隆进行分析,得到PCV1 RNA
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 青海省 辣椒 病毒 鉴定 基因组 序列 克隆
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。