基于蛋白质组学的癸醛抑制扩展青霉机制分析.pdf
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1、扩展青霉是果蔬采后病害主要致病菌之一,对果蔬产业具有巨大的危害植物精油主要抑菌成分癸醛能够显著抑制扩展青霉的生长发育,并对扩展青霉诱导的苹果青霉病具有较好的防治效果利用 技术探讨了外源癸醛对扩展青霉蛋白质组水平的影响,结果表明,基于差异表达蛋白分析,癸醛处理能够破坏扩展青霉胞内氧化还原状态的平衡,抑制胞内氨基酸代谢,影响隔膜蛋白的表达和空间结构,进而抑制扩展青霉的生长发育研究结果为阐明癸醛的抑菌机制提供了理论基础关键词:扩展青霉;癸醛;蛋白质组;抑菌机制中图分类号:文献标志码:文章编号:()引言扩展青霉(犘 犲 狀 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿犲 狓 狆 犪 狀 狊 狌 犿)是果蔬采后病害主
2、要致病菌之一,该菌为死体营养型病原真菌,菌丝体为浅白色或无色,分生孢子梗外形呈扫帚状,蓝绿色分生孢子多为球形、短柱形或椭圆形在环境中广泛存在且抗逆性强,可通过土壤、污水或空气等多种途径传播,一旦侵染宿主即可迅速扩繁,引起被侵染组织软化、水化,最终导致果实病理性腐烂 同时扩展青霉还能分泌棒曲霉素和橘霉素等真菌毒素 ,毒素在果肉中迅速扩展,表皮清洗和移除病灶并不能完全清除棒曲霉素具有较强的神经毒性、免疫毒性、基因毒性以及致畸和致癌作用,进入人体后能够引起诸如代谢紊乱、痉挛、溃疡、水肿、恶心呕吐等症状,严重危害我国居民的健康联合国粮农组织世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会指出人体对棒曲霉素的每日耐
3、受量为 体质量 根据国家统计局数据,年扩展青霉的主要宿主苹果、梨的全国产量分别为 及 万,两者总产量占全国水果总产量的 ,加强对扩展青霉的防治具有重要的应用价值及现实意义目前,针对扩展青霉的防治主要依赖人工合成杀菌剂,但过量使用农药不但会造成环境污染,还会诱导菌株产生抗药性 ,因此寻找高效、低毒且环保的新型抑菌物质尤为迫切近年来,植物精油因其复杂的组成和天然抑菌属性受到了越来越多的关注癸醛,又称十碳醛或正癸醛,分子式为(),是一种无色或淡黄色液体,香气轻辛微甜,浓度较低时有橘子或橙子的香气,天然存在于柠檬草油、柑橘油或橙花油等多种植物精油之中食品安全国家标准 中规定为食品添加剂,大鼠经口半数致
4、死量 为 作为精油中一种重要的抑菌活性成分,癸醛在采后病害防治中已经有过很多实践应用,但多数研究局限于癸醛的使用方式、应用强度以及对病原菌发育的影响,其确切的抑菌机理尚不明晰 因此,本研究以具有重大危害的扩展青霉作为研究对象,通过生理、生化水平检测,确定癸醛对扩展青霉的抑制作用,并利用相对和绝对定量的等量异位标签(,)技术探讨了癸醛处理对扩展青霉蛋白质组水平的影响研究结果有助于在分子水平阐明癸醛对致病真菌发育及致病力的调控机制,为癸醛在生产实践的有效应用提供理论基础材料与方法 实验材料扩展青霉为本实验室自有菌种,表型及遗传背景明确;红富士苹果购买自当地市场,无明显病、虫害及机械损伤,成熟度基本
5、一致;癸醛(货号:)购自美国 公司;(,货号:)和 (,货号:)培养基购自北京索莱宝科技有限公司;荧光素二乙酸酯(,货号:)、,二脒基 苯基吲哚(,货号:)、吐温 (,货号:)及其他常规试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司 生理及生化指标检测收集新鲜的扩展青霉孢子加入到 培养基中,调节孢子浓度为 个,加入癸醛使其最终体积分数分别为、和 振荡培养,培养、以及 后统计孢子萌发率培养、以及 后,离心收集对照组和 癸醛处理组的菌丝,恒温烘干并称重将 浓度为 个 的孢子悬浮液均匀涂布在直径为 的 培养基上,中分别含有和 癸醛,静置培养,分别培养、和后,用含 吐温 的无菌水收集孢子,统计产孢量收集新
6、鲜孢子加入到 培养基中,调节孢子浓度为 个,加入癸醛使其最终体积分数分别为和 ,振荡培养培养后进行 染色,培养 后进行 染色,染色方法参考 等 方法,利用 荧光显微镜进行观察,拍照将 浓度为 个 的孢子悬浮液均匀涂布在 培养基上,用无菌打孔器获取直径为 的琼脂圆饼,放置于含有或 癸醛的 培养基上,对照组和癸醛处理组各包含 个生物学重复,静置培养,培养、以及后测量菌落直径挑选大小及成熟度基本一致的苹果果实,次氯酸钠浸泡消毒 ,无菌水漂洗后风干,用无菌接种针在果实赤道部刺孔,每个小孔接种浓度为 个 的孢子悬浮液,处理组的孢子悬浮液中含有 的癸醛,室温静置培养,接种、以及后统计病斑直径,拍照记录病果
7、表型 蛋白质组学分析收集新鲜的孢子加入到 的 培养基中,调节孢子浓度为 个,加入癸醛使其最终体积分数分别为和 ,振荡培养,显微镜观察确定表型后,离心收集孢子及菌丝混合物,无菌水漂洗两次后液氮速冻,每个处理进行一次生物学重复,样品保存至 冰箱病原菌总蛋白提取及 分析由杭州联川生物技术股份有限公司提供技术服务,操作严格按照实验流程进行步骤简述如下:称取 样品,液氮条件下研磨至粉末,裂解缓冲液溶解后冰浴超声处理,离心取上清并用倍体积丙酮沉淀总蛋白,重复上述步骤,将获得的总蛋白溶解在裂解缓冲液中,定量后使用精确取出 蛋白,用胰蛋白酶()在 下酶解,真空离心干燥后用四乙基溴化铵缓冲液(,)溶解肽段,进行
8、 标签标记,然后利用岛津 液相系统进行强离子交换(,)分离,再利用 质谱仪 进杭州师范大学学报(自然科学版)年行 分析,离子源为 (,美国),放射器为石英材料拉制的喷针(,美国)测序结果分析下机数据经 软件处理后以 格式保存,利用 软件进行数据库检索,检索参数设置如下,搜索类型:;酶:;片段质量公差:;分子量值:;可变修饰:(),(),();肽 段 质 量 公 差:;仪 器 类 型:;最 大 缺 失:;固 定 修 饰:(),(),()蛋白定量需要该蛋白至少包含两个不同肽段,相对表达量用 均值表示当一个蛋白在不同处理组中,犘值小于 ,且蛋白相对表达量比值均小于 或大于 时,则认定该蛋白的表达发生
9、了显著变化蛋白注释通过 软件检索 中 扩 展 青 霉 基 因 组 序 列(:?;:),并利用 ()数据库对已注释的蛋白进行分类差异表达蛋白(,)的()和 ()富集分析分别在 数据库(:)以及 数据库(:)中进行 数据分析除特殊说明外所有实验包含个生物学重复,每个实验重复次,利用 对数据进行单因素方差分析,犘 时表示差异显著结果与分析 癸醛处理对扩展青霉发育及致病力影响误差线代表标准误,不同小写字母代表显著性差异犘 孢子萌发;菌丝积累;产孢图癸醛处理对扩展青霉的影响犉 犻 犵 犈 犳 犳 犲 犮 狋 狊狅 犳犱 犲 犮 犪 狀 犪 犾 狋 狉 犲 犪 狋 犿 犲 狀 狋 狅 狀犘犲 狓 狆 犪
10、狀 狊 狌 犿癸醛对扩展青霉抑制作用呈浓度依赖型,经过 振荡培养,对照组扩展青霉孢子萌发率超过,癸醛处理组与对照组无明显差异,处理组的孢子萌发率则低于,当处理浓度达到 时,癸醛能够完全抑制病原菌孢子的萌发(图)为了进一步探讨癸醛对扩展青霉的抑菌机制,将 处理用于后续实验经过 的振荡培养,扩展青霉在癸醛处理下发育缓慢,菌丝量只有对照组的一半(图)同时,病原菌产孢也受到抑制,处理组产孢量显著低于对照组(图)此外,癸醛处理还能有效抑制病原菌菌落扩展,培养 后,对照组菌落已经延伸至培养皿边缘,表面铺满浓密的蓝绿色孢子,菌落边缘气生菌丝由白逐渐变淡,而癸醛处理组菌落半径尚不足对照组一半,边缘白色气生菌丝
11、明显,第期俞沁如,等:基于蛋白质组学的癸醛抑制扩展青霉机制分析孢子密度较低(图、和)通过苹果活体接种实验,浓度为 癸醛处理对苹果青霉病具有一定的防治效果,尽管对照组和处理组的苹果发病率都达到了 ,但处理组的病斑直径及接种处积累的孢子量均低于对照组(图、和)和分别为培养后对照组和癸醛处理组扩展青霉的菌落形态;和分别为接种后对照组和癸醛处理组苹果青霉病表型;癸醛处理对扩展青霉菌落扩展的影响;癸醛处理对苹果病斑直径的影响误差线代表标准误,不同小写字母代表显著性差异犘 图癸醛处理对扩展青霉菌落扩展及苹果青霉病的影响犉 犻 犵 犈 犳 犳 犲 犮 狋 狊狅 犳犱 犲 犮 犪 狀 犪 犾 狋 狉 犲 犪
12、狋 犿 犲 狀 狋 狅 狀犮 狅 犾 狅 狀 狔犲 狓 狆 犪 狀 狊 犻 狅 狀犪 狀 犱犪 狆 狆 犾 犲犫 犾 狌 犲犿 狅 犾 犱狉 狅 狋 狊 犻 狀 犱 狌 犮 犲 犱犫 狔犘犲 狓 狆 犪 狀 狊 狌 犿 扩展青霉孢子荧光染色分析利用 荧光染料对培养的孢子进行染色;利用 荧光染料对培养 的孢子进行染色图癸醛处理对扩展青霉孢子形态的影响犉 犻 犵 犈 犳 犳 犲 犮 狋 狊狅 犳犱 犲 犮 犪 狀 犪 犾 狋 狉 犲 犪 狋 犿 犲 狀 狋 狅 狀狊 狆 狅 狉 犲犿 狅 狉 狆 犺 狅 犾 狅 犵 狔狅 犳犘犲 狓 狆 犪 狀 狊 狌 犿 是一种疏水性荧光素衍生物,能在细胞中被脂
13、酶分解产生绿色荧光物质荧光素,荧光强弱可反杭州师范大学学报(自然科学版)年映细胞膜的完整性及细胞活力在 中振荡培养后,癸醛处理的孢子大小低于对照组,经 染色后荧光强度也明显弱于对照组,表明孢子发育受到了抑制,细胞的活力较低(图)培养 后,对照组孢子进一步膨大并萌发,芽管明显,通过 染色观察,胞内多为双核或多核,圆形或卵形轮廓清晰可见,而癸醛处理的孢子基本没有萌发,细胞内为单核且呈现明显的不规则形态,表明遗传物质的复制也受到了抑制(图)癸醛处理对扩展青霉蛋白质组图谱的影响对照及处理组样品提取的蛋白经定量及 凝胶电泳分离后,浓度和质量均符合 分析标准,酶解并标记完成的肽段经质谱仪进行分析,共获得了
14、 个二级谱图,通过 蛋白鉴定软件分析,匹配到数据库的谱图数为 ,匹配到特有肽段的谱图数为 ,鉴定到特有肽段数为 ,鉴定到蛋白数为 通过 注释发现,约有的蛋白功能尚不清晰,其他蛋白功能分布则表现出多样性和复杂性,其中涉及翻译、核糖体结构及合成、次级代谢产物合成转运及代谢、氨基酸转运及代谢、能量合成及转化的蛋白数量最多(图)通过蛋白相对定量分析发现,癸醛处理后共检测到 个 ,其中 个表达上调,个表达下调(图)丰度变化范围为 以及 ,上调和下调幅度最大的各个 信息如表所示 加工及修饰;染色质结构及动力学;能量合成及转化;细胞周期控制、细胞分裂及染色体分离;氨基酸转运及代谢;核苷酸转运及代谢;糖代谢及
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