黎药海南地不容氧化克班宁对人乳腺癌MCF-7细胞微管位点和微管蛋白的调控机制研究.pdf
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1、海南医学院学报 2023,29(15)Journal of Hainan Medical University黎药海南地不容氧化克班宁对人乳腺癌 MCF7 细胞微管位点和微管蛋白的调控机制研究肖迪1,闫彩凤1,于晶涵1,许声江2,王先正2,王正文2(1.哈尔滨商业大学药学院,黑龙江 哈尔滨 150076;2.海南省肿瘤医院肝胆胰外科,海南 海口 570000)摘要 目的:本论文深入探究黎药海南地不容抗乳腺癌活性化合物氧化克班宁对微管网络的破坏能力,研究氧化克班宁在分子层面和细胞层面对微管网络稳态的影响。方法:首先采用 EBI位点竞争法和分子对接来确定氧化克班宁对微管位点的占据力;其次,采用 W
2、estern Blot法检测 STAT3、PKA1、CAMK4和PKA 检测氧化克班宁对微管蛋白的影响。结果:EBI位点竞争法结果显示,EBI与 微管蛋白加合物比 微管蛋白出现在分子量更小的区域(ctrl2)。分子对接结果显示,氧化克班宁可以占据微管蛋白的秋水仙碱位点。Western Blot结果显示,低、中、高 3个浓度的氧化克班宁或阳性药 Taxol作用 MCF7细胞 48 h后,显著降低 STAT3 蛋白表达水平(P0.01),显著降低 PKA1 和 CAMK4 蛋白表达水平(P0.05,P0.01),并且可降低 PKA 蛋白表达水平,与对照组差异均有统计学意义(P0.01)。结论:氧化
3、克班宁结合在微管蛋白秋水仙碱位点扰乱微管蛋白聚合,造成 MCF7细胞有丝分裂,从而导致 MCF7细胞死亡。氧化克班宁可通过抑制 MCF7 细胞中 STAT3、PKA1、CAMK4 和 PKA 蛋白的表达水平,干扰纺锤体形成,最终造成 MCF7细胞有丝分裂灾难。关键词 黎药海南地不容;氧化克班宁;MCF7细胞;微管位点;微管蛋白中图分类号 R29 文献标识码 A 文章编号 1007-1237(2023)15-1121-07Study on regulating mechanisms of oxocrebanine obtained from Stephania hainanensis H.S.L
4、o et Y.Tsoong on microtubule sites and tubulin in human breast cancer MCF7 cellsXIAO Di1,YAN Caifeng1,YU Jinghan1,XU Shengjiang2,WANG XianZheng2,WANG Zhengwen2 (1.College of Pharmacy,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China;2.Hepatobiliary and Pancreatic Surgery,Hainan Cancer Hospital,Haiko
5、u 570000,China)Foundation Project:This study was supported by Natural Science Foundation of Hainan Province(820RC776).Author:XIAO Di,M.M.,Email:.Correspondence to:WANG Zhengwen,Associate Chief Physician,M.D.,Email:zhwwang_.Received:20230209 Revised:20230605 JHMU,2023;29(15):11211127View from special
6、ist:It is creative,and of certain scientific and educational value.ABSTRACT Objective:To determine the destructive ability of oxocrebanine,an antibreast cancer active compound obtained from Stephania hainanensis H.S.Lo et Y.Tsoong,on microtubule network,and investigate the effect of oxocrebanine on
7、microtubule network homeostasis at both molecular and cellular levels.Methods:the EBI site competition method and molecular docking method were used to determine the occupation of the microtubule site of oxocrebanine.Western Blot was used to detect the effect of oxocrebanine on microtubuleassociated
8、 proteins including STAT3,PKA1,CAMK4,and PKA.Results:The results of EBI site competition assay showed that the binding of EBI to Tubulin covalent fusions produced adducts that appeared in regions of lower molecular weight than tubulin(ctrl 2).Molecular docking results showed that oxocrebanine could
9、occupy the colchicine site of microtubule proteins.As revealed by Western Blot,the expression of STAT3 protein was decreased after MCF7 cells have been treated with low,medium,and high concentration of oxocrebanine or the positive drug taxol for 48 h(P0.01).DOI:10.13210/ki.jhmu.20230612.001网络出版地址:ht
10、tps:/ 海南省自然科学基金项目(820RC776)作者简介 肖迪,医学硕士,Email:。通讯作者 王正文,副教授,医学博士,Email:zhwwang_。收稿日期 20230209 修回日期 20230605 网络出版时间:20230612 15:52:171121海南医学院学报 Vol.29 No.15 Aug.2023The expression levels of PKA1 and CAMK4 proteins aslo showed significant reductions(P0.05,or P0.01).Oxocrebanine also decreased the PKA
11、 protein in MCF7 cells compared to the control group(P0.01).Conclusion:Oxocrebanine,a ligand that binds at the colchicine site of tubulin,perturbs tubulin polymerization and causes mitosis in MCF7 cells,thus leading to MCF7 cell death.Oxocrebanine may promote microtubule dynamics through stathmin by
12、 inhibiting the expression levels of STAT3,PKA1,CAMK4,and PKA proteins in MCF7 cells.Oxocrebanine interfers with spindle formation,and ultimately causes mitotic catastrophe in MCF7 cells.KEYWORDS Stephania hainanensis H.S.Lo et Y.Tsoong;Oxocrebanine;MCF7 cell line;Microtubule site;Microtubule protei
13、n海南地不容(Stephania hainanensis H.S.Lo et Y.Tsoong)系防己科千金藤属植物,又名金不换、山乌龟,草质藤本,属海南特有植物。生于海南岛大山石缝、峭壁、乱石堆的半阴处或溪边丛林中1。海南地不容作为海南黎族的传统医药,块根入药。味苦,性寒,有小毒。具有清热解毒、抗菌抗炎、截疟、理气、止痛等功效。海南地不容中主要含有异喹啉型生物碱、阿扑啡型生物碱、原小檗碱型生物碱和吗啡型生物碱。这些生物碱具有抗肿瘤、抗氧化、抗惊厥、抗血小板凝集等多种生物活性,用于治疗癌症、损伤和炎症2,3。课题组前期实验从海南地不容分离得到的阿朴菲类生物碱单体化合物氧化克班宁(结构式见图 1
14、),具有抗乳腺癌活性,其敏感细胞株为 MCF-7细胞,IC50为 16.66 mol/L4。微管是由、-微管蛋白异二聚体组成的圆柱形结构。通过抑制微管蛋白聚合或阻断微管的解聚,干扰微管的动态平衡,最终阻碍微管的正常功能导致细胞死亡。秋水仙碱是第一个确定的微管蛋白破坏剂5。目前进入临床试验的肿瘤血管阻断剂多为微管抑制剂,其中又多为作用于秋水仙碱位点的化合物6。Stathmin 是一种微管不稳定蛋白,它与,-微 管 蛋 白 异 二 聚 体 结 合,调 节 微 管 动 力。STAT3 与 Stathmin 结合的位置是羧基末端区域,Stathmin 是 STAT3 维 持 微 管 形 态 的 直 接
15、 靶 点,STAT3 的 过 量 表 达,拮 抗 Sathmin 的 微 管 解 聚活性7。前期研究发现,海南地不容氧化克班宁作为拓扑异构酶和微管蛋白的双重抑制剂,可同时干扰 MCF-7 细胞的微管结构和动态平衡8。本论文进一步观察氧化克班宁对 MCF-7 细胞微管网络的影响,通过对作用位点、信号通路等途径探讨氧化克班宁对微管网络的作用机制;在微观层面,通过检测氧化克班宁对微管调控蛋白的影响,进一步确定氧化克班宁促进微管解聚的机制。1 材料与方法 1.1材料人乳腺癌 MCF7 细胞由哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心提供;氧化克班宁(Oxocrebanine,98%)由海南医学院提供,紫杉醇购
16、自上海源叶生物科技有限公司(货号 B21695),秋水仙素购自碧云天生物科技有限公司(货号:ST1173),N,N,亚甲基双丙烯酰胺(EBI,2iodoiV 2 2 2 2 iodoacetyl ethyl acetamide)购自博奥森生物集团有限公司(货号:BA09167173),DMSO 购自天津市富宇精细化工有限公司(货号:20200605),RPMI1640培养基购自大连美伦生物科技有限公司(货号:MA0215Nov17H),胰蛋白酶购自美国 Sigma药物公司(货号:20200603),胎牛血清购自广州翔博生物科技有限公司(货号:20201013);电泳仪(型号:DYY7C)、垂直
17、电泳转印槽(型号:DYCZ40D)购自北京六一生物技术有限公司,凝胶成像系统购自 GE美国通用电气公司(型号:ImageQuant LAS500)。1.2方法1.2.1EBI 竞争法测定氧化克班宁竞争微管位点氧化克班宁给药浓度为 8.33、16.66、33.32 mol/L,秋水仙碱的终浓度为 6.8 mol/L,作用 MCF7细胞48 h 后,用 EBI(100 mol/L)孵育 2 h,空白对照组每孔加同体积 RPMI 1640 培养基,收集细胞,加入RIPA 裂解液裂解 30 min,4、12 000 r/min 离心图 1氧海南地不容氧化克班宁结构式Fig 1The structura
18、l formula of oxocrebanine in Stephania hainanensis H.S.Lo et Y.Tsoong1122肖迪等.黎药海南地不容氧化克班宁对人乳腺癌 MCF7细胞微管位点和微管蛋白的调控机制研究15 min,提取蛋白。蛋白样品上样,低中高剂量组分别加入 EBI,经 10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,转至 PVDF 膜,于 5%脱脂牛奶中封闭60 min后抗体孵育。1.2.2分子对接利用分子模拟软件 AutoDock 进行分子对接研究。微管蛋白晶体结构从 PDB 数据库(PDB:1SA0)下载。采用 AutoDock 对晶体结构进行处理,包括提取配体
19、、去除水分子、加氢、添加部分电荷和最小化能量。同时用 ChemDraw 软件画出氧化克班宁结构图,然后利用 PyMOL 软件构建待测化合物的三维结构,最小化能量后生成构象库。选择默认的对接参数将化合物对接到定义的对接点。1.2.3 Western Blot 法 测 定 STAT3、PKA1、CAMK4、PKA 蛋白表达的变化氧化克班宁给药浓度为 8.33、16.66、33.32 mol/L,秋水仙碱浓度为6.8 mol/L,作用 MCF7 细胞 48 h 后,提取蛋白。蛋白样品经 10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳,转 至 PVDF 膜,于 5%脱 脂 牛 奶 中 封 闭 60 min,
20、分 别 加 入 兔 抗 人 STAT3、PKA1、CAMK4、PKA 抗体,4 孵育过夜;TBST 洗涤 3 次,加入二抗,室温孵育 60 min;TBST 洗涤 3 次,加入 ECL 发光试剂显影。1.3统计学处理采用 SPSS for Windows 21.0 软件对数据进行分析处理。多样本组间均数比较采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)和 LSD 多重比较分析法进行。P0.05 为差异具有统计学意义。2 结果 2.1氧化克班宁对微管位点的作用以 EBI竞争实验确定氧化克班宁是否作用于微管蛋白的秋水仙碱位点,如图 2所示,EBI与 微管蛋白共价融合产生的加合物出现在分子量更小的区
21、域(ctrl2),且随着氧化克班宁的浓度逐渐增高,加合物条带也随之消失,高浓度组出现的情况与秋水仙碱对照组相同。2.2分子对接实验结果推测氧化克班宁通过结合微管蛋白而靶向微管,使用 AutoDock 软件研究氧化克班宁和微管蛋白(PDB:1SA0)融合及连接,评估氧化克班宁和微管蛋白的融合方式。结果显示,氧化克班宁可以占据微管蛋白的秋水仙碱位点,如图 3所示,氧化克班宁能够与 Lys254,Leu255,Cys241 和 Leu248 的残基形成疏水作用;氧化克班宁中的亚甲二氧基与Asn258形成氢键。证明氧化克班宁可能是一种与微管蛋白结合的抑制剂。2.3氧化克班宁对人乳腺癌 MCF7细胞微管
22、关键蛋白的影响2.3.1氧化克班宁对 MCF7 细胞微管调控蛋白A:tubulin蛋白表达条带;B:tubulin蛋白表达柱状图;Ctrl2为空白组+EBI试剂图 2EBI实验验证氧化克班宁靶向秋水仙碱位点Fig 2EBI assay verified that oxocrebanine targeted colchicine sites表 1 氧化克班宁对乳腺癌 MCF7细胞 tubulin表达水平的影响(n=3,x s)Tab 1 Effect of oxocrebanine on the expression level of tubulin in MCF7 cells(n=3,x s)
23、组别空白组 1空白组 2氧化克班宁ColchicineFP质量浓度(mol/L)008.3316.6633.326.80tubulin native0.910.040.890.050.760.04*0.570.06*0.180.04*0.260.03*274.000.00tubulin adduct00.670.030.500.05#000136.690.00注:与空白对照组 1 比较,*P0.01,与空白对照组 2 比较,#P0.01。1123海南医学院学报 Vol.29 No.15 Aug.2023STAT3 的 影 响 实 验 结 果 如 图 4 和 表 2 所 示,STAT3 的蛋白灰
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