红景天苷对近视豚鼠脉络膜厚度及HIF-1α和多巴胺及其受体表达的影响.pdf
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1、实验论著红景天苷对近视豚鼠脉络膜厚度及 和多巴胺及其受体表达的影响赵 爽房祥杰张娟美赵 军许莞菁郑凌方付艺璇引用:赵爽房祥杰张娟美等.红景天苷对近视豚鼠脉络膜厚度及 和多巴胺及其受体表达的影响.国际眼科杂志():基金 项 目:临 沂 市 人 民 医 院 研 究 生 培 养 基 金 项 目(.)作者单位:()中国山东省济南市山东第一医科大学()中国山东省临沂市人民医院眼科()中国山东省青岛市青岛大学()中国山东省潍坊市潍坊医学院()中国辽宁省锦州市锦州医科大学作者简介:赵爽在读硕士研究生研究方向:白内障、玻璃体视网膜疾病通讯作者:张娟美博士副主任医师硕士研究生导师研究方向:白内障、玻璃体视网膜疾
2、病.收稿日期:修回日期:摘要目的:探讨红景天苷()对透镜诱导型近视()豚鼠脉络膜厚度及缺氧诱导因子()、多巴胺及其 受体表达的影响方法:将 只 周龄豚鼠随机分为正常对照()组、组和透镜诱导型近视红景天苷()组每组 只 组正常饲养给予/生理盐水灌胃 组豚鼠右眼前配戴 透镜建立近视模型给予/生理盐水灌胃 组豚鼠右眼前配戴 透镜同时给予/红景天苷(/)灌胃 造模 后测量各组豚鼠右眼屈光度、眼轴长度及脉络膜厚度通过实时荧光定量()和免疫组织化学()检测各组豚鼠右眼脉络膜视网膜 及蛋白表达量通过酶联免疫吸附实验()和 法检测多巴胺浓度及其 受体表达量结果:造模 后与 组比较 组和 组豚鼠右眼屈光度均负向
3、增加眼轴均延长脉络膜厚度均减小脉络膜视网膜 和蛋白表达量均增加多巴胺浓度及其 受体表达量均降低与 组比较 组豚鼠右眼近视屈光度明显减小眼轴长度较短脉络膜厚度增加脉络膜视网膜 和蛋白表达量均降低多巴胺浓度及其 受体表达量均增加结论:红景天苷干预近视豚鼠可通过影响脉络膜厚度及、多巴胺及其 受体的表达延缓近视进展关键词:红景天苷透镜诱导型近视脉络膜缺氧诱导因子()多巴胺:./.:(.):.:()()().:()()././.()().国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.().:.:.:():.()():引言近视作为一种最常见的屈光不正主要表现为远视力下降近年来发病率不断上升到
4、 年 等预计全球将有.亿近视患者和.亿高度近视患者基因和环境两大因素通过控制眼轴增长影响近视的形成和发展 目前研究显示在近视发展过程中巩膜组织缺氧引起缺氧诱导因子 ()等表达增加促进巩膜重塑及眼轴增长而多巴胺()及其受体在调节眼球屈光状态发育中也起到重要作用 因此抗氧化应激药物和针对多巴胺及其受体的药物可能是未来控制近视进展的有效选择 红景天苷是一种从传统中药大株红景天中提取出的化合物具有抗氧化应激及下调 表达等作用主要应用于心血管系统、神经系统和肿瘤等疾病 目前国内学者使用红景天苷对形觉剥夺型近视豚鼠模型进行干预结果证明红景天苷可抑制近视模型豚鼠 表达的上调减缓实验性近视进展而不影响豚鼠正常
5、眼的生长 红景天苷对近视的具体作用机制尚不明确需要进一步实验进行验证 本研究旨在探讨红景天苷对透镜诱导型近视豚鼠脉络膜厚度及、多巴胺及其 受体表达的影响 材料和方法.材料.实验动物 选取 周龄雌性健康三色豚鼠 只体质量 购自湖北中医药高等专科学校实验动物中心许可证号:(鄂)入组前实验动物进行双眼检查排除角膜病变、白内障、眼底病变等 饲养条件:室温 空气相对湿度 予 光照光照强度 黑暗循环 实验期间所有豚鼠自由摄食、进水并提供富含维生素的饲料及新鲜蔬菜等以补充维生素 本研究动物使用经临沂市人民医院伦理委员会审批同意(伦审号:)实验中严格遵守视觉与眼科动物研究协会()关于动物的处理原则.主要试剂及
6、仪器主要试剂:复方托吡卡胺滴眼液(沈阳兴齐眼药股份有限公司).盐酸丙美卡因滴眼液(比利时.公司)体积分数.戊二醛溶液(国美集团化学试剂有限公司)抗体()免疫显色试剂 羊抗鼠/兔二抗试剂(通灵生物)显色试剂盒()多巴胺检测试剂盒(优尔生)兔单抗()()红 景 天 苷(源 叶)主要仪器:眼科/型超声测量仪(天津迈达)带状光检影镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)镜片箱(丹阳医疗器械厂)病理切片机(德国 公 司)生 物 组 织 摊 烤 片 机(武 汉 俊 杰)抗原修复用电陶炉()显微镜(奥林巴斯)包埋机(武汉俊杰).方法.模型建立及分组将 只 周龄健康三色雌性豚鼠随机分为正常对照()组、透镜诱导型近视
7、()组、红景天苷透镜诱导型近视()组 组每组 只适应性饲养 后开始豚鼠 模型的建立剃除右眼眶周体毛在右眼前粘贴镜片实验过程中每天检查镜片是否脱落及模糊如果脱落则及时粘贴上并进行镜片清洗护理 组不做特殊干预仅给予/生理盐水灌胃 组在右眼前粘贴 透镜诱导给予/生理盐水灌胃 组在右眼前粘贴 透镜诱导的同时给予/红景天苷药剂灌胃剂量为/干预持续 随后腹腔注射过量戊巴比妥钠实施安乐死各组随机选取 只豚鼠取右眼眼球进行石蜡包埋切片另外 只豚鼠取右眼眼球置于冰块上沿角膜缘环形剪开眼球去除眼前节组织、玻璃体及巩膜后于冰箱中保存.各组豚鼠屈光度及眼轴长度测量 所有豚鼠在造模前造模 后使用复方托吡卡胺滴眼液充分散
8、大右眼瞳孔采用带状光检影镜在暗室条件下行检影验光取水平和垂直两条主子午线检验的平均值作为屈光度每只眼连续测量 次取平均值记录每只豚鼠右眼的屈光度 以.盐酸丙美卡因滴眼液进行双眼表面麻醉使用眼科 型超声诊断仪测量右眼眼轴长度仪器参数设置为前房传播速度/玻璃体传播速度/晶状体传播速度/测量时探头对准瞳孔垂直于角膜平面不对角膜造成压迫得到清晰稳定且晶状体后囊膜和视网膜双峰均高于基线的图像时记录确认测量 次取平均值.各组豚鼠脉络膜厚度测量 选取每组已经制作出的部分眼球石蜡包埋切片依次行苏木素染液染色、返蓝和伊红染液染色接着梯度乙醇脱水、二甲苯透明风干后中性树胶封片固定显微镜下观察切片染色情况 每张切片
9、于光镜下从后极部中央向两边连续取 个视野在 .:/.:.图像分析系统下测量脉络膜厚度每个视野测量 次取平均值.检测脉络膜视网膜 相对表达水平 从已冻存的每只眼的脉络膜视网膜组织中提取部分组织采用 法提取 逆转录得到 通过实时荧光定量()技术检测 的相对表达量选取 为内参基因 引物序列:上游引物:下游引物:大小为 上游引物:下游引物:大 小 为 采 用法计算目的基因的相对表达量将 组目的基因的相对表达量设置为.检测脉络膜视网膜 蛋白表达选取每组已经制作出的部分眼球石蜡包埋切片抗原修复后行脉络膜视网膜 免疫组织化学()检测一抗为()二抗为免疫显色试剂 羊抗鼠/兔二抗试剂 使用相同来源的样品做不加抗
10、体的空白对照实验过程中控制染色时间一致减少染色程度不同引起的差异 染色后的切片显微镜下观察拍照使用 .软件对 照片进行光密度分析每张切片选取 张 倍照片分析光密度.检测脉络膜视网膜多巴胺浓度 从已冻存的每只眼的脉络膜视网膜组织中提取部分组织用预冷的./(.)冲洗称重后将组织剪碎然后按 的重量体积比加入 到研磨器中充分冰浴研磨 最后将匀浆液 /离心 取上清检测组织样本采用多巴胺检测试剂盒进行酶联免疫吸附实验()检测酶标仪测定吸光度(值)使用 软件进行拟合制作标准曲线按照标准曲线的公式结合检测结果计算多巴胺表达水平.检测多巴胺 受体蛋白相对表达水平 从已冻存的每只眼的脉络膜视网膜组织中提取部分组织
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