高龄小鼠来源精原干细胞长期培养体系的建立.pdf
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1、高龄小鼠来源精原干细胞长期培养体系的建立汤瑞玲范立青(.湖北科技学院医学部基础医学院人体解剖教研室湖北 咸宁.中南大学湘雅医学院基础医学院生殖与干细胞工程研究所)摘要:目的 建立高龄小鼠精原干细胞()体外长期培养体系 方法 将 只 月龄昆明白小鼠用于本实验组织形态学技术评估睾丸生精状态优化睾丸体细胞去除流程、原代和传代中饲养层与生长因子组合条件观察小鼠 克隆形成、增殖与传代细胞生物学与分子生物学技术检测小鼠 克隆的干细胞特征 结果 高龄小鼠睾丸精曲小管存在生精损害精原细胞数量增加优化实验条件后富集的精原细胞数量增加体外成功培养传代高龄小鼠 克隆 个月高龄小鼠 克隆具有 活性并表达、等精原干细胞
2、标记物 结论 本研究通过优化消化、富集、原代和传代培养的多个环节成功建立高龄小鼠 体外长期培养体系关键词:高龄小鼠精原干细胞体外长期培养 中图分类号:文献标识码:文章编号:()开放科学(资源服务)标识码():./.():.:湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()基金项目:年市科协科技创新智库课题()通讯作者:.随着全球进入后工业化时代生育年龄推后以及二胎政策的施行高龄父亲()的生殖状态及其对子代健康的影响已经成为全球研究热点 临床人群研究显示高龄父亲子代发生先天畸形、儿童肿瘤、智力低下、精神疾病如孤独症和精神分裂症以及不良孕产史的风险大大增加 高龄雄性睾丸中精原干细胞()发生的新发基因
3、突变和表观遗传异常均可通过精子传递从而导致严重的子代健康问题称为父亲年龄效应()父亲年龄超过 岁导致 疾病风险呈指数级增加小鼠睾丸细胞转录组学显示 月龄 即开始表达衰老相关基因 目前 衰老研究集中于新生期和性成熟期小鼠来源的 体外长期培养造成的遗传和表观遗传改变直接来源于高龄小鼠睾丸 体外培养体系尚未见报道 本研究拟建立 月龄小鼠睾丸来源 体外培养体系可以完整保存 发生衰老改变时的遗传、表观遗传、基因表达特征将为阐明高龄 衰老启动时的遗传和表观遗传调控机制提供有力的研究工具 材料与方法.动物 周龄成年雄性昆明白小鼠购自湖南史莱克景达有限责任公司饲养于中南大学生殖与干细胞工程中心实验动物房用于实
4、验室正常小鼠繁殖配种 光照 黑暗水食自由所有实验动物处理均遵循实验动物管理和使用指南 只 月龄小鼠停止配种后继续饲养至 月龄用于本实验.试剂和仪器 培养基、高糖、维生素、丙酮酸钠、购 自 美 国 公 司 购自美国 公司、购自 公司、和 均购于美国 公司腐胺、()葡萄糖、乳酸、维生素、生物素、巯基乙醇购自 公司 胶原酶、中性蛋白酶和.胰酶/购自美国 公司透明质酸酶和 酶购自美国 公司.明胶购自美国 公司/碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自美国 公司兔抗小鼠 多克隆抗体、兔抗小鼠 多克隆抗体、兔抗小鼠 多克隆抗体、鼠抗 单克隆抗体均购自美国 公司兔抗 购自 公司驴血清、标记驴抗兔二抗、标记驴抗小鼠二抗购自
5、美国 公司 免疫组化试剂盒购自中国福建迈新公司 购自美国 公司 逆转录试剂盒购自美国 公司 购自日本 公司江丰数字切片扫描仪购自中国江丰公司体视光学显微镜购自德国蔡司公司倒置相差荧光显微镜购自日本尼康公司水套式二氧化碳培养箱购自美国 公司.实验方法.高龄小鼠睾丸切片 染色和 检测 表达 周龄和 月龄昆明白小鼠脱颈致死睾丸用 固定液固定梯度酒精脱水二甲苯透明石蜡包埋切片切片厚度 免疫组化()染 色:常 规 脱 蜡 至 水/甘氨酸脱甲醛 过氧化氢消除内源性生物素正常羊血清封闭 稀释兔抗 抗体孵育过夜生物素标记羊抗兔二抗室温孵育链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶室温孵育 显色苏木素复染中性树脂封片 苏木素伊
6、红()染色:常规脱蜡至水苏木素染色.盐酸酒精分色自来水返蓝 醇溶伊红染色 中性树脂封片 和 切片使用江丰数字切片扫描仪扫描 阅片软件截屏拍照.三步酶消化法消化高龄小鼠睾丸获取单细胞悬液()配制消化酶 消化酶:高糖 加入/胶原酶、/透明质酸酶消化酶:高糖 加入/胶原酶、/透明质酸酶、/中性蛋白酶、/酶消化酶:.胰酶/加入/酶.无菌过滤器 保存过滤备用()三步酶消化 脱颈处死 月龄雄性昆明白小鼠 只取出双侧睾丸去除睾丸白膜在体式显微镜下用钟表镊分离精曲小管之间的间质组织和血管 洗涤 次将松散完整精曲湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()小管移到 离心管中加入 消化酶进行第一步消化:水浴 次
7、/震荡消化 加入 高糖 和 终止消化静置沉降 共 次吸弃上清中的间质组织和细胞直至洗涤液清亮 吸管轻轻吹吸精曲小管 次 离心 收集上清单细胞悬液管底沉淀的精曲小管片段加入 消化酶进行第二步消化:水浴 次/震荡消化 加入 终止反应 吸管轻轻吹吸 次帮助精曲小管和细胞团块解离 离心 收集上清单细胞悬液 不含钙镁的 洗涤管底的精曲小管残迹和细胞团块 离心 管底沉淀的细胞团块加入 消化酶进行第三步消化:水浴 次/震荡消化 加入 终止消化 吸管轻轻吹吸 次直至细胞团块完全解离将第一、二、三步消化中收集的全部细胞悬液用 目无菌筛网过滤 离心 高糖 和 洗涤含 的精原干细胞培养液重悬细胞计数.个细胞台盼蓝染
8、色检测细胞活性达以上 将细胞按 /的密度接种到.明胶预包被的 个 皿中 差异贴壁培养.高龄小鼠精原干细胞原代培养()配制小鼠精原干细胞培养液 加入 专用补充物作为基础培养基逐次加入 维生素、丙酮酸钠、/腐胺、/()葡萄糖、/乳酸、/维生素、/生物素、/、/、/巯基乙醇根据需要的浓度最后加入胎牛血清().无菌过滤器过滤 保存备用()小鼠来源胚胎成纤维细胞饲养层和条件培养基制备 小鼠胚胎成纤维细胞()培养液由高糖 添加 组成液氮罐取出冻存的 代 小鼠来源 解冻后加入 培养液 接种到.明胶预包被的 大皿常规换液培养 以 比例传代 代换液常规培养 至细胞铺满皿底 洗涤 次加入配有/丝裂霉素 的 培养液
9、、培养.洗涤、消化、离心收集丝裂霉素 处理的 代 按 /管加入冻存液放入液氮中冻存冻存液由 和 组成 制备条件培养基时按./.接种密度铺入 孔板中的 孔加入 精原干细胞培养液每隔 收集条件培养基并更换新鲜精原干细胞培养液 后观察饲养层细胞状态如果不佳即丢弃()高龄小鼠精原干细胞原代培养 差异贴壁培养 后倒置显微镜下见 个 中皿贴壁体细胞约占皿底/生殖细胞悬浮在培养液中少量细胞相互积聚形成细胞团块收集上清生殖细胞细胞计数.以.接入铺有密度为./.饲养层的 孔板中 孔加入 含 的精原干细胞培养液 培养翌日观察到绝大部分生殖细胞已贴壁仅少许悬浮细胞隔日换液每个培养孔加入 条件培养液和新鲜精原干细胞培
10、养液各 记为 代()高龄小鼠精原干细胞的传代培养 代细胞培养 后倒置显微镜下见 孔板 个孔的生殖细胞大量死亡漂在培养液中 饲养层上剩余的精原细胞堆积成大量小细胞团块 每孔加入/中性蛋白酶 /胶原酶消化 轻轻吹吸皿底至饲养层上的生殖细胞团块完全脱落皿底仅剩余部分饲养层细胞等体积含有 的 终止反应 离心 按 传代接入铺有密度为/.饲养层的 孔板中 孔继续培养记为 代第 观察到精原细胞呈葡萄串状聚集可见多个包含 个细胞的精原干细胞克隆形成/中性蛋白酶/胶原酶消化传代传代比例 从 到 代高龄小鼠 克隆增殖比较缓慢传代间隔为 传代比例为 或 在此期间保持精原干细胞培养液中 的浓度、来源 饲养层铺皿密度
11、/.如果出现细胞 不增殖时可加入新鲜解冻的 增加饲养层密度或者加入 条件培养基以促进高龄小鼠 克隆增殖 代以后高龄小鼠 克隆体外增殖处于稳定状态传代间隔缩短至 传代比例为 代开始将精原干细胞培养液中 以每周下降 的梯度逐渐调整至 周后再调整至饲养层接种密度调整至./.体外稳定传代培养 个月共传 代在传代和实验需要之外将 孔板中湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()每孔细胞加入由 和 配制的冻存液放入 个冻存管置入液氮中保存.高龄小鼠精原干细胞克隆的干性、精原干细胞标记物检测()染色检测 克隆的碱性磷酸酶活性 代 接种到 个孔内常规培养 第 进行 克隆的 染色:吸弃培养液洗涤 次 多聚甲
12、醛 室温固定 双蒸水 洗 次每次 按照使用说明书配制/染色液加 染色液入培养孔室温孵育 吸弃染色液用双蒸水洗 次各 倒置显微镜观察 克隆颜色变化如果呈浅蓝色可继续加入染色液再染 双蒸水洗涤 次 克隆细胞呈深蓝色时拍照()免疫荧光检测 克隆的精原细胞标记物的蛋白表达情况 代 接种到 个孔内常规培养 第 进行 克隆的免疫荧光染色吸弃培养孔内的培养液 洗涤 次 多聚甲醛 室温固定 洗 次各正常驴血清 室温封闭 吸弃驴血清分别加 一抗:和 兔抗多克隆抗体、鼠抗单克隆抗体用 驴血清按 浓度稀释、兔抗多克隆抗体用含有.的 驴血清按 浓度稀释阴性对照孔留置封闭液 冰箱孵育过夜 洗 次各 加入 稀释的 标记驴
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